Protein-DNA recognition plays an extremely important role for the genetic regulation in all living organisms. Proteins are involved in the control of DNA replication, transcription, repair, condensation, packaging, and transport. A complete understanding of the biological functions of protein?DNA interaction requires knowledge of dynamic and static properties of protein?DNA complexes, such as three dimensional structures, the relevance of the structure to environmental conditions, kinetics, thermodynamics, and many others. Among the multitude of methods that are necessary for the achievement of further progress, Raman spectroscopy is a valuable tool with specific merits and contributions in the field. We applied Raman spectroscopy for the analysis of w2?operator DNA complex, Arc?operator DNA complex, KorB?operator DNA complex, and Sac7d?decamer d(GAGGCGCCTC)2 complex. The pSM19035-encoded dimeric w protein (w2) regulates the transcription of genes required for the control of plasmid copy number and stable inheritance. It is a member of the MetJ/Arc structural superfamily of repressors featuring a ribbon-helix-helix DNA binding motif. w2 binds specifically to promoter regions containing at least two consecutive copies of a 5?-A/TATCACA/T-3? (top strand) sequence composed of seven base pairs. Binding of w2 to oligonucleotides composed of heptads is connected with significant changes in the Raman difference spectra (spectrum of complex minus spectra of DNA and w2 protein). The Raman markers indicate direct contacts with adenine, guanine, and thymine in the major groove of operator DNA suggesting that the central 5?-ATCAC-3? stretch of the heptads might be the main target site for w2 binding to operator DNA. The Raman data also indicate that Thr29 is essential for operator DNA binding and probably makes a hydrogen bond with one of the bases. Surprisingly, the spectral features are rather similar that were observed upon binding of w2 to oligonucleotides composed of different numbers (one, two or four) and different orientation (direct or inverted) of heptads. The results point to a high flexibility and adaptability of both w2 and DNA upon complex formation. Solution properties of Arc repressors (wild type and F10H variant) from Salmonella typhimurium bacteriophage P22 and their complexes with operator and non-operator DNA were characterized by circular dichroism, fluorescence, and Raman difference spectroscopy. Raman markers in the difference spectra (spectrum of the complex minus spectra of DNA and Arc) indicate binding of Arc in the major groove, several direct contacts, e.g. hydrogen bonds of protein side chains with bases, and slight perturbations of the deoxyribose ring systems that are consistent with bending of the operator DNA. Trp14, the only one tryptophan of Arc repressor monomers, serves as a very sensitive tool for monitoring properties of the hydrophobic core of the protein. The Raman spectra identify a largely different c2,1 rotation angle of Trp14 in the a Arc variant with His instead of Phe at position 10 (Arc-F10H) compared to that in wild type Arc. In complexes of Arc-wt and Arc-F10H with DNA, however, the Trp14 c2,1 rotation angles are similar in both proteins. Furthermore, in both complexes a strengthening of the van der Waals interactions of the phenyl ring of Trp14 is indicated compared to these interactions in the free proteins. The Raman difference spectra of Arc repressor?non-operator DNA complex indicate unspecific interactions which are very different for both Arc-F10H and Arc-wt proteins. KorB protein encoded by the conjugative plasmid RP4 is a global regulator controlling the expression of plasmid genes the products of which are involved in replication, transfer and stable inheritance. KorB is a homodimeric protein which binds to palindromic 13-bp DNA sequences (5?-TTTAGC(G/C)GCTAAA-3?) present 12 times on the 60-kb plasmid. Details of the KorB? and KorB-O?operator DNA complex were investigated and compared with known crystal structure of KorB-O?operator DNA complex. The KorB-O subunit recognizes and binds to the operator sequence (OB). Comparison of the Raman spectra of free KorB-O domain and OB DNA with the spectrum of the complex reveals large differences. KorB-O binds in the major groove of the OB DNA and Raman markers clearly indicate hydrogen bonds to guanine N7 and O6. The KorB-O?DNA interactions induce changes in the DNA backbone and in the secondary structure of the protein. Wild type KorB and KorB-O bind in the same way to operator DNA as shown by the similarity of the Raman difference spectra of the complexes. Members of the Sso7/Sac7 protein family and other related proteins are believed to play an important role for DNA packaging and maintenance in archeons. Sac7d is a small, abundant, basic and non-specific DNA-binding protein of the hyperthermophilic archeon Sulfolobus acidocaldarius. Structures of several complexes of Sso7d/Sac7d with DNA octamers have shown sequence unspecific minor groove binding of the proteins and sharp kinking of the double helix. Corresponding Raman vibrational signatures have been identified in this study. A Raman spectroscopic analysis of Sac7d binding to the oligonucleotide decamer d(GAGGCGCCTC)2 reveals large conformational perturbations of the DNA structure upon complex formation. Large changes in the DNA backbone and partial B- to A-form DNA transitions are indicated that are closely associated with a C2´-endo/anti to C3´-endo/anti conversion of the deoxyadenosyl moiety upon Sac7d binding. The major spectral feature of Sac7d binding indicates kinking of the DNA. Minor groove binding is displayed by guanine N2 and guanine N3 signals and supported by Trp24 features. Trp24 is the only tryptophan residue present in Sac7d. Binding of Trp24 to guanine N3 was demonstrated in crystal structures of Sac7d?DNA complexes. No changes of the Sac7d secondary structure have been detected upon DNA binding.
Protein-DNA-Erkennung spielt eine äußerst wichtige Rolle bei der Genregulation in allen lebenden Organismen, wobei die Proteine in die Kontrolle der DNA- Replikation, der Transkription, der Reparatur, der Kondensation, der Verpackung und des Transports eingebunden sind. Ein vollständiges Verständnis der biologischen Funktionen der Protein-DNA-Wechselwirkung erfordert die Kenntnis der dynamischen und statischen Eigenschaften von Protein-DNA- Komplexen, wie deren dreidimensionale Strukturen, die Relevanz der Strukturen zu den Umgebungsbedingungen, sowie kinetische, thermodynamische und andere Daten. Aus der Vielzahl von Methoden, die für den weiteren Erkenntnisfortschritt erforderlich sind, ist die Raman-Spektroskopie eine nützliche Methode von hohem Wert. Sie kann spezifische Beiträge zur Untersuchung von Proteinen, Nukleinsäuren und Protein-Nukleinsäure-Komplexen erbringen und wurde in der vorgelegten Dissertation für die Analyse von w2 -Operator-DNA-Komplexen, Arc-Operator-DNA-Komplexen, KorB-Operator-DNA- Komplexen und von Sac7d-Decamer d(GAGGCGCCTC)2-Komplexen eingesetzt. Das pSM10035-kodierte dimere w-Protein (w2) reguliert die Transkription von Genen, deren Produkte für die Kontrolle der Anzahl an Plasmidkopien und für die stabile Vererbung der Plasmide benötigt werden. w2 gehört zur Superfamilie der MetJ/Arc-Repressoren, deren Mitglieder mit einem sog. ?Ribbon-Helix-Helix? ?Motif zur DNA-Bindung ausgestattet sind. w2 bindet mit hoher Spezifität an DNA-Heptaden der Sequenz 5?-A/TATCACA/T-3? (Topstrang), die sich in der Promotorregion mehrfach wiederholen. Die Bindung von w2 an Oligonukleotide, die als Modelle für Operator-DNA mindestens zwei Heptaden enthalten, ist mit signifikanten Änderungen in den Raman-Spektren verbunden. Diese Änderungen werden in Differenzspektren deutlich, die durch Subtraktion der Spektren von DNA und w2 vom Spektrum des Komplexes berechnet werden. In den Differenzspektren sind spezifische Raman-Markerbanden zu sehen, die direkte Kontakte des Proteins mit Adenin, Guanin und Thymin in der großen Furche der Operator-DNA anzeigen. Diese Befunde sprechen für die Bedeutung des zentralen Basenabschnitts 5?-ATCAC-3? der Heptaden als entscheidendem Bindungsbereich für die Bindung von w2 an die Operator-DNA. Weiterhin ist aus den Raman-Daten abzuleiten, dass Thr29 essentiell für die Operator-DNA-Bindung ist und wahrscheinlich eine Wasserstoffbrücke mit einer der Basen bildet. Überraschenderweise sind die spektralen Eigenschaften der Komplexe von w2 mit Oligonukleotiden unterschiedlicher Heptadenanzahl (eine, zwei bzw. vier) sowie unterschiedlicher Orientierung der Heptaden (direkt oder invers) weitgehend ähnlich, diese Befunde weisen auf eine hohe Flexibilität und Anpassung der Konformationen von w2 und DNA bei der Komplexbildung hin. Der vom Bakteriophagen P22 aus Salmonella typhimurium kodierte Arc-Repressor und eine Variante von Arc (Arc-F10H) sowie deren Komplexe mit DNA wurden mittels Zirkulardichroismus, Fluoreszenz- und Raman-Differenzspektroskopie charakterisiert, um Eigenschaften der Proteine und der DNA-Komplexe in Lösung zu ermitteln. Es wurde ein spezifisch bindendes Oligonucleotid, dessen Sequenz von der des Arc-Operators abgeleitet war, sowie ein Oligonucleotid mit gleicher Basenzusammensetzung, aber zufälliger Sequenz eingesetzt. Raman- Marker in den Differenzspektren (Spektrum des Komplexes abzüglich der Spektren von DNA und Arc-Repressor) weisen auf die Bindung von Arc in der großen Furche, auf mehrere direkte Kontakte, z.B. Wasserstoffbrückenbindungen der Proteinseitenketten mit den Basen und auf geringe Veränderungen des Deoxyriboseringsystems hin und stehen in Übereinstimmung mit einer Krümmung der Operator-DNA im Komplex. Der Arc-Repressor enthält nur einen Tryptophanrest pro Monomer in Position 14 (Trp14), der als sehr empfindliche Sonde für die Charakterisierung der Eigenschaften des hydrophoben Kerns des Proteins eingesetzt werden kann. Aus den Raman-Spektren ergeben sich deutlich unterschiedliche c2,1 Rotationswinkel für Trp14 in der Arc-F10H-Variante im Vergleich zum Arc-Wildtyp. In den DNA-Komplexen der beiden Proteine sind jedoch die Tryptophane ähnlich orientiert. Verglichen mit den freien Proteinen wird in den Komplexen eine Zunahme der van der Waals-Wechselwirkungen des Trp14-Phenylringes beobachtet. Bei den hohen Konzentrationen im mM-Bereich, die für die Raman-Messungen eingesetzt wurden, binden Arc-Wildtyp und Arc-F10H auch an das Oligonucleotid mit zufälliger Sequenz. Die Raman-Differenzspektren dieser Komplexe zeigen unspezifische Wechselwirkungen an, die sich deutlich von den spezifischen Wechselwirkungen der Proteine mit Operator-DNA unterscheiden. Ebenfall deutlich verschieden ist das Verhalten der von Arc- F10H und Arc-Wildtyp ausgebildeten Komplexe. Das vom konjugativen Plasmid RP4 kodierte Protein KorB ist ein globaler Regulator, der die Expression von Plasmidgenen kontrolliert, deren Produkte an der Replikation, am Transfer und an der stabilen Vererbung des Plasmids RP4 beteiligt sind. KorB ist ein homodimeres Protein, das an eine 13 Basenpaare lange palindromische DNA- Sequenz (5?-TTTAGC(G/C)GCTAAA-3?) bindet, die zwölfmal im 60-kb-Plasmid vorkommt. Komplexe aus KorB und KorB-O mit Operator-DNA wurden Raman- spektroskopisch untersucht und mit der bekannten Kristallstruktur des Komplexes aus KorB-O und Operator-DNA verglichen. Korb-O ist eine rekombinant hergestellte Domäne von KorB, das die Operatorsequenz (OB) erkennt und bindet. Der Vergleich der Raman-Spektren der freien KorB-O-Domäne und der OB-DNA mit dem Spektrum des Komplexes läßt große Differenzen erkennen. KorB-O bindet in der großen Furche der DNA. Die Raman-Marker zeigen Wasserstoffbrücken zwischen KorB-O und Guanin-N7 und -O6 an. Die Wechselwirkungen von KorB mit der DNA induzieren Änderungen im DNA-Rückgrat und in der Sekundärstruktur des Proteins. Die Ähnlichkeit der Raman-Differenzspektren der Komplexe von Wildtyp-KorB und KorB-O mit Operator-DNA zeigt, dass beide Proteine in gleicher Weise an die Operator-DNA binden. Es wird vermutet, dass Proteine der Sso7/Sac7-Familie und andere verwandte Proteine in Archebakterien eine wichtige Rolle bei der DNA-Verpackung und bei deren Aufrechterhaltung spielen. Sac7d ist ein kleines, weit verbreitetes, basisches und unspezifisch an DNA bindendes Protein aus dem hyperthermophilen Archebakterium Sulfolobus acidocaldarius. Kristallstrukturen verschiedener Komplexe von Sso7d/Sac7d mit DNA-Oktameren zeigen eine Bindung der Proteine in der kleinen Furche und einen scharfen Knick der Doppelhelix an. Entsprechende Raman-Banden wurden in der vorliegenden Arbeit identifiziert. Eine Raman-spektroskopische Analyse der Sac7d-Bindung an das Dekamer d(GAGGCGCCTC)2 weist auf große Veränderungen der DNA-Konformation hin, die mit der Bindung des Proteins induziert werden. Es werden beträchtliche Änderungen im DNA-Rückgrat und partielle Übergänge von der B- DNA zur A-Form - nach Bindung von Sac7d beobachtet, die eng mit einem C2?-endo/anti zu C3?-endo/anti Übergang des Deoxyadenosylrestes verbunden sind. Die signifikanten spektralen Merkmale der Sac7d-Bindung deuten auf einen Knick in der DNA hin. Die Bindung in der kleinen Furche wird durch Guanin-N2 und -N3 Signale angezeigt und durch spektrale Eigenschaften des Trp24, dem einzigen Tryptophanrest in Sac7d, gestützt. Die Bindung von Trp24 an Guanin N3 wurde in Kristallstrukturen von Sac7d-DNA-Komplexen nachgewiesen. Es wurden keine Änderungen der Sac7d-Sekundärstruktur nach DNA-Bindung festgestellt.
