Eine erhöhte Konzentration von Sauerstoff trägt entscheidend zur Pathogenese der neonatalen Hirnschädigung bei, was im späteren Leben zu einer neurokognitiven Beeinträchtigung der Frühgeborenen führen kann (17,120). Daher ist es von großer klinischer Bedeutung, die Pathomechanismen der Neurotoxizität des Sauerstoffs in der vulnerablen Phase des Gehirnwachstums von Frühgeborenen zu verstehen. Dies bietet dann eine mögliche Grundlage für eine medikamentöse Prävention und Therapie. Sechs Tage alte Han Wistar Ratten wurden randomisiert in vier Gruppen eingeteilt und wie folgt behandelt: (1) Normoxie (21% O2) und Natriumchlorid i.p., (2) Normoxie und 1mg TRP601/kg/KG i.p., (3) Hyperoxie (80% O2) und Natriumchlorid i.p., (4) Hyperoxie und 1 mg TRP601/kg/KG i.p. Wir verwendeten einen kürzlich entwickelten Pentapeptid- basierten-Gruppe-II-Caspase-Inhibitor (5-(2,6-difluoro- phenoxy)-3(R,S)-(2(S)-(2(S)-(3-methoxy- carbonyl-2(S)-(3-methyl-2(S)-((quinoline-2-carbonyl)-amino) butyrylamino)pro- pionylamino) 3-methylbutyrylamino)propionylamino)-4-oxo-pentanoic-acid- methylester; TRP601). 12 bzw. 24 Stunden nach Beginn der Behandlung wurden die Ratten getötet. Sie wurden mit PBS transkardial perfundiert und anschließend dekapitiert. Die Gehirne wurden entnommen und für Fluoro-Jade B-Färbungen, Western-Blot-Analysen und Messungen der enzymatischen Aktivitäten der Caspase-2 und -3 vorbereitet. Zur statistischen Auswertung wurde eine Varianzanalyse (one-way ANOVA) mit nachfolgendem Student´s t-Test durchgeführt. Die Standardabweichung und Standardfehler wurden berechnet und die Werte auf Signifikanz untersucht, um signifikante Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen aufzeigen zu können, wobei ein Wert von p<0.05 als signifikant galt. Diese Arbeit zeigt, dass Hyperoxie zu einer deutlichen Zunahme der Caspase-2-Expression führt, was wiederum zur Einleitung der intrinsischen Apoptose mit Hochregulation der wichtigsten Proteine – nämlich Cytochrom c, Apaf-1 und AIF – führt, während Bid und das anti-apoptotische Bcl-2 herunterreguliert werden. Diese Ergebnisse fallen mit einer Erhöhung der Caspase-3-Aktivität und somit ausgeprägter Neurodegeneration zusammen. Jedoch bewirkt die einmalige Applikation von TRP601 die Umkehrung der Hyperoxie- induzierten Veränderungen in diesem Modell. Diese Arbeit zeigt, die Beteiligung der Caspase-2 an der intrinsischen Apoptose bei Hyperoxie- induzierter Schädigung des unreifen zentralen Nervensystems. Wir berichten zum ersten Mal, dass TRP601 einen neuroprotektiven Effekt bei Hyperoxie- induzierter Apoptose hat und sowohl den intrinsischen Caspase-abhängigen als auch den Caspase-unabhängigen Weg beeinflusst. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit einer kürzlich veröffentlichten Studie, die über eine Schutzwirkung von TRP601 in anderen Tiermodellen der perinatalen Hirnschädigung an Jungratten berichtet (128) und schlagen verschiedene mögliche molekulare Mechanismen vor, wie diese neuroprotektive Wirkung von TRP601 möglich ist. TRP601 scheint ein vielversprechender Kandidat zur Neuroprotektion in der Neonatologie sein.
Oxygen contributes to the pathogenesis of neonatal brain damage, leading to neurocognitive impairment of prematurely born infants in later life (17,120). We have identified a critical role for receptor-mediated neuronal apoptosis in the immature rodent brain. The contribution of the intrinsic apoptotic pathway accompanied by activation of caspase-2 under hyperoxia in the neonatal brain still remains elusive. Inhibition of caspases appears a promising strategy for neuroprotection in neonatal brain injury. 6-day-old Han Wistar rats were randomly assigned to four groups and treated as follows: (1) normoxia (21% O2) and vehicle i.p., (2) normoxia and 1mg TRP601/kg/KG i.p., (3) hyperoxia (80% O2) and vehicle i.p. (4) hyperoxia and 1 mg TRP601/kg/KG i.p. We applied a recently developed pentapeptide-based group II caspase-inhibitor (5-(2,6 -difluoro-phenoxy) -3(R,S)-(2(S)-(2(S)-(3-methoxy-carbonyl-2(S)-(3-methyl-2(S )-((quino-line-2-carbonyl)-amino) butyrylamino)pro- pionylamino)3methylbutyrylamino)propionyl-amino)-4-oxo-pentanoic-acid- methylester; TRP601). 12 or 24h after treatment, postnatal day-6 pups were killed. They were transcardially perfused with PBS and decapitated. Brains were removed and prepared for Fluoro-Jade B staining, Western blot analysis and detection of caspase-2 and -3 enzymatic activities. Data were analyzed by R Project for Statistical Computing and presented as mean±standard error. Group effects were assessed by ANOVA, followed by independent sample t-test multiple comparison. Adjusted P-values of <0.05 were considered statistically significant. We report that elevated oxygen (hyperoxia) levels trigger a marked increase in active caspase-2 expression, resulting in an initiation of the intrinsic apoptotic pathway with upregulation of key proteins, namely, cytochrome c, Apaf-1 and AIF, whereas Bid and the anti-apoptotic Bcl-2 are downregulated. These results coincide with an upregulation of caspase-3 activity and marked neurodegeneration. However, single treatment with TRP601 at the beginning of hyperoxia reversed the detrimental effects in this model. The present study reveals the involvement of caspase-2 in combination with the intrinsic apoptotic cascade in hyperoxia-induced injury to the immature central nervous system. We report for the first time that TRP601 provides strong evidence for neuroprotective action against hyperoxia-induced apoptosis influencing intrinsic caspase-dependent and also caspase-independent pathways. Our results are in line with a recently published report of a protective effect of TRP601 in other rodent models of perinatal rodent brain injury, (128) and suggest different potential molecular mechanisms that may entertain this tissue-protective effect of TRP601. TRP601 seems to be a auspicious prospect for neuroprotection in neonatology.
