Fragestellung: Das Wilms-Tumor-Protein 1 ist ein Transkriptionsfaktor, der u.a. für die Entwicklung des Herzens und der Nieren notwendig ist. WT1 ist außerdem als Tumorsuppressor wirksam und wird in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert. Die Diaminoxidase AOC1 (Amine Oxidase Copper-containing 1) degradiert Putrescin und hat damit eine wichtige Funktion im Polyaminstoffwechsel. Polyamine sind organische Polykationen, die u.a. Zellproliferations- und Differenzierungsprozesse beeinflussen. Darüber hinaus spielen sie auch eine Rolle in der Entwicklung des Herzens und der Nieren sowie in der Entstehung von Tumoren. In dieser Arbeit wurde die Hypothese überprüft, dass die Expression der AOC1, und damit der Polyaminkatabolismus, durch den Transkriptionsfaktor WT1 reguliert wird. Methoden: Hierfür wurde die AOC1 mRNA nach Veränderung der WT1 Expression in verschiedenen Zelllinien sowie in primären embryonalen Epikardkulturen und in den Herzen von Wt1 Knockoutembryonen der Maus gemessen. Mittels Reportergenassays wurde die Regulation des AOC1-Promotors durch WT1 untersucht. Die Bindung von WT1 an den AOC1-Promotor wurde durch Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) und Chromatin-Immunpräzipitations (ChIP)-Assays analysiert. Die Lokalisation von AOC1 und WT1 Protein in embryonalen Herzen erfolgte mittels Immunhistochemie. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass Kotransfektion von WT1 zu einer signifikanten Zunahme der AOC1 Promotoraktivität führt. Mutation einer transkriptionsstartnahen, in silico ermittelten WT1 Bindungsstelle verhinderte diesen WT1 Effekt. Der EMSA und ChIP-Assay bewiesen, dass WT1 tatsächlich an den AOC1-Promotor bindet. Die Regulation der AOC1 Expression durch WT1 konnte auch in verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden, in denen eine signifikante Korrelation der Expression von WT1 und AOC1 festgestellt wurde. Die Expressionsniveaus von AOC1 und WT1 waren auch in den Herzen von Wildtyp- und Wt1-heterozygoten (Wt1+/-) bzw. homozygoten (Wt1-/-) Knockoutembryonen der Maus sowie in primären embryonalen Epikardkulturen assoziiert. Mittels immunhistochemischer Färbungen konnte ferner gezeigt werden, dass AOC1 und WT1 im embryonalen Epikard co-exprimiert werden. Schlussfolgerungen: Diese Resultate belegen, dass WT1 die Transkription der AOC1, und dadurch möglicherweise den terminalen Polyaminkatabolismus, stimuliert. Nachdem zuvor bereits das für die Polyaminsynthese limitierende Enzym ODC (Ornithin- Decarboxylase) als WT1 Zielgen beschrieben wurde, scheint der Polyaminmetabolismus somit ein zentraler Mediator der WT1 Effekte zu sein. WT1 und Polyamine haben komplexe Funktionen während der Embryonalentwicklung und in der Genese von Tumoren. In dieser Arbeit werden Mechanismen diskutiert, wie die Regulation der AOC1 durch WT1 das Tumorwachstum und die Embryonalentwicklung, insbesondere die Reifung des Herzens, beeinflussen kann. Weiterhin wird die Bedeutung der WT1-abhängigen AOC1 Expression für die epithelial-mesenchymalen Transition im embryonalen Epikard dargestellt.
Introduction: The Wilms tumor protein 1 is a transcription factor with an essential function for the development of the heart and kidneys. WT1 additionally acts as a tumor suppressor gene but is also highly expressed in several tumors. The diamine oxidase AOC1 (Amine Oxidase Copper-containg 1) degrades putrescine and therefore plays an important role in the polyamine metabolism. Polyamines are organic polycations, which, among other things, affect cell proliferation and differentiation. They are also involved in the development of the heart, kidneys and in tumor formation. This thesis examines the hypothesis that transcription of AOC1 gene, and therefore the polyamine catabolism, is controlled by WT1. Methods: AOC1 mRNA was measured in the hearts of Wt1 knockout mouse embryos, in primary embryonic epicardial cells, and in different cell lines with variable WT1 levels. Regulation of the AOC1 promoter by WT1 was examined with reporter gene assays. The binding of WT1 to the AOC1 promoter was analysed using Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) and Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Localization of AOC1 and WT1 proteins in the embryonic heart was studied by immunohistochemical staining. Results: Co-transfection of WT1 resulted in a significant increase in AOC1 promoter activity. Mutation of an in silico predicted WT1 binding site close to the transcription start abolished this effect. EMSA and ChIP proved the binding of WT1 to the AOC1 promoter. Regulation of AOC1 expression by WT1 was shown in different cell lines, in terms of a significant correlation between the AOC1 and WT1 expression levels. AOC1 and WT1 expression levels were also correlated in wild type-, Wt1-heterozygous (Wt1+/-) and Wt1-homozygous (Wt1-/-) mouse hearts, as well as in primary embryonic epicardial cells. Immunohistochemical staining showed a co-localisation of AOC1 and WT1 protein in the embryonic epicardium of the mouse. Conclusion: These results demonstrate that WT1 stimulates the transcription of the AOC1 gene and thereby possibly regulates the terminal polyamine catabolism. The fact that WT1 is already known to regulate the rate limiting enzyme of the polyamine synthesis ODC (Ornithine Decarboxylase) suggests the polyamine metabolism as a major mediator of WT1’s effects. WT1 and polyamines play complex roles during embryonic development and tumor genesis. This thesis discusses several potential mechanisms by which the regulation of AOC1 through WT1 could influence tumor growth, embryonic development and especially the development of the heart. It furthermore illustrates the relevance of the WT1 dependent regulation of AOC1 for the epithelial-mesenchymal transition in the embryonic epicardium.
