dc.contributor.author
Moter, Annette
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:02:39Z
dc.date.available
2011-03-18T08:24:35.127Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11377
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15575
dc.description.abstract
Die wichtigste Aufgabe der medizinischen Mikrobiologie ist die Isolierung und
Identifizie¬rung humanpathogener Organismen. Für die korrekte Wahl der
Antibiotikatherapie und somit für die Prognose des Patienten ist eine
schnelle, sensitive und spezifische Erregerdiagnostik von größter Wichtigkeit.
Dabei sind die kulturellen Verfahren mit Anzucht der Infektionserreger auf
festen oder in flüssigen Nährmedien zur Isolierung und Anreicherung
individueller Spezies mit nachfolgender biochemischer Differenzierung ein
fester Bestandteil der Routinediagnostik. Bereits kurz nach Probeneingang kann
ein gefärbtes Direktpräparat wertvolle Hinweise für die initiale
Therapieempfehlung geben. Nach erfolgreicher Anzucht folgt nach ein bis drei
Tagen eine präzisere Erregerdifferenzierung. Viele Mikroorganismen sind jedoch
schwer oder bisher nicht kultivierbar. Die Nährstoffbedürfnisse dieser
anspruchsvollen Spezies sind zu spezifisch und komplex, um sie unter
Laborbedingungen zu kultivieren. Andere Spezies wachsen zu langsam, um eine
zeitnahe Erregeridentifikation zu ermöglichen. Auch für die Untersuchung von
Probenmaterial von antibiotisch vorbehandelten Patienten sind kulturell
basierte Techniken oft ungeeignet. Hier werden zunehmend molekularbiologische
Verfahren eingesetzt, da sie das genetische Material der Mikroorganismen
kulturunabhängig nachweisen. Ein Nachteil der meisten molekularbiologischen
Methoden ist es jedoch, dass sie keine Information über räumliche Verteilung
der Mikroorganismen zueinander oder im Kontext mit dem Gewebe erlauben. Somit
sind insbesondere die hochsensitiven Nukleinsäure-Amplifikationstechniken
kontaminationsanfällig und positive Nachweise von Krankheitserregern können
nur unter Berücksichtigung klinischer Befunde interpretiert werden. Hier
findet die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ihre Anwendung, bei
welcher fluoreszenz-markierte Oligonukleotidsonden spezifisch an komplementäre
RNA-Sequenzen im Bakterium binden. Sie erlaubt somit die Visualisierung und
gleichzeitig kulturunabhängige Identifikation von Mikroorganismen in ihrem
natürlichen Habitat und bildet somit die Brücke zwischen Molekularbiologie,
Mikrobiologie und Pathologie. Die FISH ist ein viel versprechendes Verfahren,
das sich zu einem wertvollen Instrument für die Analyse mikrobieller Biofilme
sowie die mikrobiologische Routinediagnostik entwickelt hat. Sie schlägt eine
Brücke zwischen Molekulargenetik und konventioneller Fluoreszenzmikroskopie
und eignet sich damit auch für den Einsatz in den Laboratorien, die nicht die
räumlichen, personellen und auch finanziellen Voraussetzungen für eine
zuverlässige und kosteneffiziente molekulargenetische Diagnostik erfüllen. Der
Einsatz der FISH für diagnostische Fragestellungen wurde am Beispiel der
Blutkulturdiagnostik, der Endokarditis und der Mykobakteriosen diskutiert.
Dabei erwies sich die Technik insbesondere bei Infektionen durch schwer
kultivierbare Erreger wie Bartonella quintana, Tropheryma whipplei oder
Mycobacterium leprae sowie nach antibiotischer Vorbehandlung als hilfreich.
Durch die räumliche Auflösung kann die FISH Fragen beantworten, die derzeit
mit keiner anderen Technik bearbeitet werden können. So liefert sie wertvolle
Informationen für die Infektionsbiologie, wie die Erforschung komplexer
Biofilme, wie am Beispiel der Parodontitis gezeigt. Weiterhin kann sie für
Untersuchungen zur Relevanz schwer kultivierbarer und nicht kultivierter
Mikroorganismen, aber auch für funktionelle Analysen, wie Bakterium-Wirt
Interaktionen eingesetzt werden. Diese Eigenschaft wurde bei den
Untersuchungen zur Dermatitis digitalis genutzt. Darüber hinaus gibt die FISH
Auskunft zum rRNA Gehalt einer einzelnen bakteriellen Zelle und somit ihrer
Aktivität in situ, wie bei den Biofilmen der infektiösen Endokarditis
demonstriert. Es ist daher denkbar, dass sogar Vitalitätsmessungen von
Bakterien in Biofilmen möglich sind, was neue Perspektiven der in situ Analyse
der Biofilm Regulation eröffnet.
de
dc.description.abstract
The ultimate goal of medical microbiology is the fast and specific detection
of pathogens. Conventional microbiological diagnosis is mainly based on
culture-dependent methods that often fail due to previous antibiotic therapy
or the involvement of fastidious or slowly growing microorganisms. During the
last years molecular techniques entered the field of routine diagnostics.
These mainly amplification based techniques are culture independent and highly
sensitive, but they carry the risk of false positive results and do not give
information about spatial distribution of the bacteria, their interaction with
the host, or bacterial community structures. It is generally accepted that the
favoured lifestyle of bacteria in natural environments is the biofilm. Medical
biofilms are present on a wide range of interfaces in the human body. Whereas
biofilms have been studied extensively in vitro, we are just beginning to
learn about their structure and function in vivo because models fail to
display the high complexity of the microenvironments in the human body. Direct
detection of microorganisms in diagnostic specimens by fluorescence in situ
hybridization (FISH) allows identification of the causative agent and
simultaneous visualization within the histological context. We used FISH for
fast identification of Gram-positive cocci in blood cultures, for detection of
slowly growing bacteria, like mycobacteria in tissue sections, and for
diagnosis of fastidious organisms, like Bartonella quintana or Tropheryma
whipplei in heart valve tissues of endocarditis patients. Also yet uncultured
species like Mycobacterium leprae or oral treponemes could be visualized in
tissue sections. Furthermore, FISH was used to visualize and quantify amount,
composition, and interactions of in vivo grown biofilms. The architecture of
multispecies biofilms was analyzed using digital image analysis of oral
biofilms showing the in vivo co-localization of two pairs of microorganisms on
a single cell level. This approach can also be employed to investigate the
abundance and localisation of not yet cultivable microorganisms. The tissue
invasiveness of treponemes at the biofilm-host interface was shown for digital
dermatitis. On heart valves of endocarditis patients we detected structured
biofilms that were highly organized and similar to biofilms described in in
vitro systems. The endocarditis biofilms showed stratification with zones of
elevated rRNA levels alternating with layers of only DAPI positive cells that
were presumably dead. We also found FISH positive bacteria in culture negative
samples and samples from patients under antibiotic therapy, indicating recent
metabolic activity of the cells. In summary, these findings show the
versatility and impact of FISH for biofilm infections and diagnostics in the
clinical setting.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
tropheryma whipplei
dc.subject
molecular diagnostics
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
In situ Verfahren zum molekularbiologischen Erregernachweis und zur Analyse
medizinisch relevanter Biofilme
dc.contributor.contact
annette.moter@charite.de
dc.contributor.firstReferee
Dr. Robert J. Palmer Jr.
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Dag Harmsen
dc.date.accepted
2011-01-24
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000021853-7
dc.title.translated
Fluorescence in situ hybridization for detection of microbial pathogens and
analysis of medical biofilms
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000021853
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000009230
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access