Die wichtigste Aufgabe der medizinischen Mikrobiologie ist die Isolierung und Identifizie¬rung humanpathogener Organismen. Für die korrekte Wahl der Antibiotikatherapie und somit für die Prognose des Patienten ist eine schnelle, sensitive und spezifische Erregerdiagnostik von größter Wichtigkeit. Dabei sind die kulturellen Verfahren mit Anzucht der Infektionserreger auf festen oder in flüssigen Nährmedien zur Isolierung und Anreicherung individueller Spezies mit nachfolgender biochemischer Differenzierung ein fester Bestandteil der Routinediagnostik. Bereits kurz nach Probeneingang kann ein gefärbtes Direktpräparat wertvolle Hinweise für die initiale Therapieempfehlung geben. Nach erfolgreicher Anzucht folgt nach ein bis drei Tagen eine präzisere Erregerdifferenzierung. Viele Mikroorganismen sind jedoch schwer oder bisher nicht kultivierbar. Die Nährstoffbedürfnisse dieser anspruchsvollen Spezies sind zu spezifisch und komplex, um sie unter Laborbedingungen zu kultivieren. Andere Spezies wachsen zu langsam, um eine zeitnahe Erregeridentifikation zu ermöglichen. Auch für die Untersuchung von Probenmaterial von antibiotisch vorbehandelten Patienten sind kulturell basierte Techniken oft ungeeignet. Hier werden zunehmend molekularbiologische Verfahren eingesetzt, da sie das genetische Material der Mikroorganismen kulturunabhängig nachweisen. Ein Nachteil der meisten molekularbiologischen Methoden ist es jedoch, dass sie keine Information über räumliche Verteilung der Mikroorganismen zueinander oder im Kontext mit dem Gewebe erlauben. Somit sind insbesondere die hochsensitiven Nukleinsäure-Amplifikationstechniken kontaminationsanfällig und positive Nachweise von Krankheitserregern können nur unter Berücksichtigung klinischer Befunde interpretiert werden. Hier findet die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ihre Anwendung, bei welcher fluoreszenz-markierte Oligonukleotidsonden spezifisch an komplementäre RNA-Sequenzen im Bakterium binden. Sie erlaubt somit die Visualisierung und gleichzeitig kulturunabhängige Identifikation von Mikroorganismen in ihrem natürlichen Habitat und bildet somit die Brücke zwischen Molekularbiologie, Mikrobiologie und Pathologie. Die FISH ist ein viel versprechendes Verfahren, das sich zu einem wertvollen Instrument für die Analyse mikrobieller Biofilme sowie die mikrobiologische Routinediagnostik entwickelt hat. Sie schlägt eine Brücke zwischen Molekulargenetik und konventioneller Fluoreszenzmikroskopie und eignet sich damit auch für den Einsatz in den Laboratorien, die nicht die räumlichen, personellen und auch finanziellen Voraussetzungen für eine zuverlässige und kosteneffiziente molekulargenetische Diagnostik erfüllen. Der Einsatz der FISH für diagnostische Fragestellungen wurde am Beispiel der Blutkulturdiagnostik, der Endokarditis und der Mykobakteriosen diskutiert. Dabei erwies sich die Technik insbesondere bei Infektionen durch schwer kultivierbare Erreger wie Bartonella quintana, Tropheryma whipplei oder Mycobacterium leprae sowie nach antibiotischer Vorbehandlung als hilfreich. Durch die räumliche Auflösung kann die FISH Fragen beantworten, die derzeit mit keiner anderen Technik bearbeitet werden können. So liefert sie wertvolle Informationen für die Infektionsbiologie, wie die Erforschung komplexer Biofilme, wie am Beispiel der Parodontitis gezeigt. Weiterhin kann sie für Untersuchungen zur Relevanz schwer kultivierbarer und nicht kultivierter Mikroorganismen, aber auch für funktionelle Analysen, wie Bakterium-Wirt Interaktionen eingesetzt werden. Diese Eigenschaft wurde bei den Untersuchungen zur Dermatitis digitalis genutzt. Darüber hinaus gibt die FISH Auskunft zum rRNA Gehalt einer einzelnen bakteriellen Zelle und somit ihrer Aktivität in situ, wie bei den Biofilmen der infektiösen Endokarditis demonstriert. Es ist daher denkbar, dass sogar Vitalitätsmessungen von Bakterien in Biofilmen möglich sind, was neue Perspektiven der in situ Analyse der Biofilm Regulation eröffnet.
The ultimate goal of medical microbiology is the fast and specific detection of pathogens. Conventional microbiological diagnosis is mainly based on culture-dependent methods that often fail due to previous antibiotic therapy or the involvement of fastidious or slowly growing microorganisms. During the last years molecular techniques entered the field of routine diagnostics. These mainly amplification based techniques are culture independent and highly sensitive, but they carry the risk of false positive results and do not give information about spatial distribution of the bacteria, their interaction with the host, or bacterial community structures. It is generally accepted that the favoured lifestyle of bacteria in natural environments is the biofilm. Medical biofilms are present on a wide range of interfaces in the human body. Whereas biofilms have been studied extensively in vitro, we are just beginning to learn about their structure and function in vivo because models fail to display the high complexity of the microenvironments in the human body. Direct detection of microorganisms in diagnostic specimens by fluorescence in situ hybridization (FISH) allows identification of the causative agent and simultaneous visualization within the histological context. We used FISH for fast identification of Gram-positive cocci in blood cultures, for detection of slowly growing bacteria, like mycobacteria in tissue sections, and for diagnosis of fastidious organisms, like Bartonella quintana or Tropheryma whipplei in heart valve tissues of endocarditis patients. Also yet uncultured species like Mycobacterium leprae or oral treponemes could be visualized in tissue sections. Furthermore, FISH was used to visualize and quantify amount, composition, and interactions of in vivo grown biofilms. The architecture of multispecies biofilms was analyzed using digital image analysis of oral biofilms showing the in vivo co-localization of two pairs of microorganisms on a single cell level. This approach can also be employed to investigate the abundance and localisation of not yet cultivable microorganisms. The tissue invasiveness of treponemes at the biofilm-host interface was shown for digital dermatitis. On heart valves of endocarditis patients we detected structured biofilms that were highly organized and similar to biofilms described in in vitro systems. The endocarditis biofilms showed stratification with zones of elevated rRNA levels alternating with layers of only DAPI positive cells that were presumably dead. We also found FISH positive bacteria in culture negative samples and samples from patients under antibiotic therapy, indicating recent metabolic activity of the cells. In summary, these findings show the versatility and impact of FISH for biofilm infections and diagnostics in the clinical setting.
