Entzündungen des Myokards können zu schwerwiegenden akuten und chronischen Beeinträchtigungen der Herzfunktion bis hin zur Herzinsuffizienz führen. Coxsackie-B-Viren gelten dabei zu den häufigsten Viren, die eine virale Myokarditis verursachen können. Molekulare und gentherapeutische Verfahren können gezielt gegen definierte Strukturen vorgehen und besitzen somit das Potential, die Spezifität und Effizienz einer antiviralen Therapie bedeutend zu erhöhen. In der vorliegenden Arbeit wurden drei verschiedene gentherapeutische Strategien hinsichtlich ihrer Effizienz und Sicherheit in vitro und in vivo untersucht. Dabei ging es in erster Linie darum, die Infektion kardialer Zellen durch CVB3, dessen Replikation und Schädigung der Wirtszelle zu verhindern. Die ersten beiden Strategien basierten auf dem Mechanismus der RNA-Interferenz, wobei der ersten Ansatz das Ziel hatte, die Anheftung des Virus an die Wirtszelle durch Silencing seines zellulären Rezeptors zu inhibieren. Dabei gelang es, die Expression des Coxsackie- Adenovirus-Rezeptors (CAR) mittels Adenovektor-expremierter short hairpin (sh)RNAs über 90 % zu inhibieren. Daraus resultierend, konnte eine Verringerung der viralen Replikation um 97 % in der kardialen Mauszelllinie HL-1 und 90 % in Rattenkardiomyozyten (NRCM) erzielt werden. In der zweiten Strategie wurden zwei shRNAs, spezifisch gegen die CVB3-RNA-abhängige RNA- Polymerase (RdRP) von einem Adeno-assozierten Virus (AAV)-Vektor (scAAV2/6-shRdRP2.4) in kardiale Zielzellen eingebracht und somit die virale Replikation in NRCM bis zu 3log10-Stufen inhibiert. Durch AAV2/9-Vektoren konnte anschließend mittels kardiospezifischen Gentransfers, die virale Replikation in einem CVB3-Myokarditis-Mausmodell um 70 % verringert werden. Zusätzlich wurde erstmals mit RNAi-Technologie ein therapeutischer Effekt auf die Virus-induzierte kardiale Pumpfunktionsstörung erzielt. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Blockade der Virus-Rezeptor-Interaktion durch lösliche Rezeptorproteine. Dabei wurde mittels Adenovektoren ein lösliches, rekombinantes Rezeptorprotein (sCAR-Fc) expremiert und dessen inhibitorische Wirkung auf die CVB3-Infektion untersucht. Um die Sicherheit bei in vivo-Anwendung zu erhöhen, wurde die Expression des sCAR-Fc mittels Tet-On-Genexpressionssystems pharmakologisch regulierbar gemacht. Dabei war es möglich die Basalaktivität des Tet-On-Systems auf ein undetektierbares Level zu minimieren, ohne die Transaktivierbarkeit negativ zu beeinflussen. Durch die Expression von sCAR-Fc konnte in vitro eine Inhibierung von CVB3 bis zu 11log10-Stufen erreicht werden. Anschließend wurde in einem CVB3-Myokarditis- Mausmodel durch prophylaktische Anwendung des Vektor-expremierten sCAR-Fc eine komplette Inhibierung viral bedingten Myokarditis erreicht.. Wurde die sCAR-Fc Expression zeitgleich mit einer CVB3-Infektion bzw. 24 Stunden später induziert, konnte eine Inhibierung der kardialen Virusinfektion und Inflammation beobachtet werden, sowie eine signifikante Abmilderung der Virus- bedingte Verschlechterung der kardialen Pumpfunktion.
Inflammation of the myocard can lead to severe acute and chronical impairment of heart function and even to cardiac insufficiency. Enteroviruses and especially coxsackie-B-viruses are one of the most common causes of viral myocarditis. Molecular and gene therapeutic trials can be directed against definite structures. They offer the potential to considerably increase specificity and thus efficiency of therapy. In this thesis different gene therapeutic methods were tested for their in vitro and in vivo efficiency in preventing infection of cardiac cells with coxsackievirus B3 (CVB3). The first and second strategy was based on RNA interference with the first strategy being directed against virus attachment to the host cell through down- regulation of the cellular coxsackievirus-adenovirs receptor (CAR). CAR was down-regulated by over 90% by adenoviral vectors encoding short hairpin (sh)RNAs directed against CAR. This leads to reduction of viral replication by 97% in the cardiac cell line HL-1 and by 90% in neonatal rat cardiomyocytes (NRCM). The second RNAi based strategy employed two shRNAs directed against a viral target, namely the RNA-dependent RNA-polymerase (RdRP) of CVB3. The corresponding shRNAs were encoded by an adenovirus-associated virus (AAV) vector (scAAV2/6-shRdRP2.4). NRCM transduced by this vector before CVB3 infection reduced viral replication up to 3log10. Furthermore AAV2/9 vectors were used for cardiac-specific gene transfer and scAAV2/9-shRdRP2.4 reduced viral replication in a CVB3-myocarditis mouse model by 70 %. For the first time it was possible to achieve a therapeutic effect on virus-induced deficiency of the cardiac function by an RNAi-based antiviral therapy by improvement of systolic and diastolic parameters. The third part of this thesis was based on a block of virus-receptor interaction by soluble receptor proteins. Therefore a recombinant soluble receptor protein (sCAR-Fc) was expressed by adenoviral vectors to evaluate the inhibitory effect on CVB3-infection. To improve the safety of this approach by in vivo application, the sCAR-Fc was expressed with a regulatable tet-on gene expression system. The tet-on system in this thesis shows no leakiness by strong trans-activation of sCAR-Fc expression. Expression of sCAR-Fc inhibited an in vitro infection of CVB3 up to 11log10. In a myocarditis mouse model cardiac virus infection and virus-induced inflammation was completely inhibited through application of vector-expressed sCAR-Fc before CVB3 infection. Additionally, sCAR-Fc was able to protected mice for CVB3-induced cardiac dysfunction. Concomitant induction of sCAR-Fc led to strong reduction of cardiac CVB3 infection, myocardial injury and inflammation. Furthermore, sCAR-Fc expression concomitant with CVB3 infection shows significantly improvement of cardiac contractility and diastolic relaxation, compared to CVB3 infected control mice. This work shows that antiviral RNAi-based therapy with shRNAs directed against CAR as a cellular target and RdRP as a viral target and the soluble receptor protein, sCAR-Fc are able to prevent or reduce CVB3-induced myokarditis.
