Hypothermia and C3 peptide promote neurite outgrowth and regeneration after traumatic CNS injury

Abstract

In response to injury and inflammation of the CNS, the expression of inflammatory mediators is often altered, and several of these factors contribute directly to the development of the neuronal injury. Hypothermia (systemic or brain-selective) influences the inflammatory response and is a well established method for neuroprotection after brain trauma. Here we provide evidence that hypothermia led to a significant increase of neurite outgrowth from brain slices (independent of neurotrophin signalling), accompanied by an increased secretion of TNF-α. Moreover, hypothermia-induced neurite extension was abolished after administration of TNF-α inhibitor and in TNF-α knockout mice. We suggest then that hypothermia not only exerts protective effects in the CNS, but also support neurite outgrowth via TNF-α as a potential mechanism of regeneration. Importantly TNF-α is known to exert its action trough the cellular pathway of the small GTPase RhoA, which plays an active and versatile role in the formation and development of axons and dendrites. Effects of RhoA are often studied by the Rho-inactivating C3 transferase (C3bot) from Clostridium botulinum. We previously reported that transferase-deficient C3bot also exerted axonotrophic activity. Using organotypical slice cultures and a hippocampal-entorhinal cortex lesion model, we detected trophic effects of a 29 amino acid transferase-deficient fragment from the C-terminus of C3bot (C3bot154-182) on length and density of outgrowing fibers from the entorhinal cortex, that were comparable to the effects elicited by full-length C3bot. In vivo, functional recovery and regeneration of corticospinal tract (CST) fibers following spinal cord injury by compression or dorsal hemisection in mice was monitored after application of the transferase-deficient C3bot. C3bot154-182 significantly improved locomotor restoration in both injury models as assessed by several behavioral paradigms. These data were supported by tracing studies showing an enhanced regenerative growth of CST fibers in treated animals. Additionally, C3bot154-182 stimulated regenerative growth of raphespinal fibers and improved serotonergic input to lumbar α-motoneurons. The observed effects were probably due to a non-enzymatic down-regulation of active RhoA by the C3 peptide as indicated by pull-down experiments. In conclusion, C3bot154-182 represents a novel, promising tool to foster axonal protection and/or repair, as well as functional recovery after traumatic CNS injury.

Hypothermie ist ein etabliertes Verfahren zur Neuroprotektion nach perinataler Asphyxie, Schlaganfall und die hypotherme Therapie wird kontrovers diskutiert nach Schädel-Hirn Trauma. Wir konnten belegen, dass Hypothermie nicht nur Schutzeffekte im ZNS ausübten kann, sondern darüber hinaus das axonale Auswachsen über eine TNF-alpha Regulierung als einen möglichen Mechanismus der Regeneration induziert. In den vorgestellten Studien wurde der Einfluss von C3 Proteinen auf die Morphologie und Regeneration von Neuronen nach Schädigung untersucht. Im Zentrum der Untersuchungen standen dabei enzymunabhängige Effekte. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Clostridium botulinum C3 Protein (C3bot) neben der bekannten ADP-Ribosyltransferase Aktivität eine zusätzliche neurotrophe Aktivität aufweist, die nicht enzymatisch vermittelt ist. Durch die Herstellung verschiedener überlappender Peptidfragmente aus der Gesamtsequenz von C3bot wurde ein Bereich innerhalb der Aminosäuren 154-182 identifiziert, der vergleichbare neurotrophe Effekte aufwies, die jedoch nicht auf einer enzymatischen Inaktivierung von Rho beruhten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die erhöhte strukturelle Komplexität hippocampaler Neurone auch von einer vermehrt ausgebildeten Anzahl synaptischer Kontakte begleitet wurde. An organotypischen Kultursystemen konnten die an dissoziierten Zellen beobachteten Effekte bestätigt und ergänzt werden. An Hirnschnitten des entorhinalen Cortex der Maus wurde sowohl durch C3bot als auch durch enzymdefizientes C3bot154-182 das Wiederauswachsen von Axonen gesteigert. An einem hippocampal-entorhinalen Läsionsmodell konnte zudem eine verbesserte Reinnervierung von hippocampalen Zielgebieten durch Axone des entorhinalen Tractus perforans dargestellt werden. Nach Feststellung der Wirksamkeit in vitro erfolgte die Überprüfung der wachstumsfördernden Eigenschaft von C3bot Peptiden auch im Tiermodell. An Rückenmarks-geschädigten Mäusen führte die Applikation von C3bot154-182 zu einer verbesserten motorischen Regeneration. Histologische Untersuchungen konnten zeigen, dass das regenerative Auswachsen von Fasern des kortikospinalen, aber auch des raphespinalen Traktes nach Behandlung mit C3bot Peptid verbessert war. Pull- down Experimente legen dabei als Mechanismus eine nicht-enzymatisch vermittelte Inaktivierung von RhoA nahe.