dc.contributor.author
Liese, Anja
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:50:09Z
dc.date.available
2013-01-15T11:38:24.645Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11067
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15265
dc.description
Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis VIII Tabellenverzeichnis X
Allgemeines Abkürzungsverzeichnis XI Abkürzungsverzeichnis der Aminosäuren XV
Abkürzungsverzeichnis Nukleobasen der DNA XVI 1 Einleitung 1 1.1
Pflanzensignaltransduktion: Ca2+ als sekundärer Botenstoff 1 1.2
Ca2+-abhängige Proteinkinase CDPK 2 1.2.1 CDPK-Proteinfamilie in A. thaliana 2
1.2.2 Biochemische Aktivierung von CDPKs 4 1.2.2.1 Die EF-Hand, ein
Ca2+-Bindemotiv 4 1.2.2.1.1 Das EF-Hand-Paar 6 1.2.2.1.2 Ca2+-Selektivität bei
der EF-Hand 7 1.2.2.2 Ca2+-abhängige Konformationsänderung von CDPKs 8 1.2.2.3
Autophosphorylierungsabhängige CDPK-Aktivität 10 1.3 Abiotischer Stress 11
1.3.1 Wassermangel als Teil des abiotischen Stresses mit Fokus auf osmotischem
Stress 11 1.4 ABA, das Signalhormon für abiotischen Stress 13 1.4.1 Funktion
der ABA 13 1.4.2 Der ABA-Rezeptor und die ABA-Signaltransduktion 14 1.4.3 ABA-
abhängige Regulation der Stomata 18 1.5 Genregulation in Abhängigkeit von ABA
und abiotischem Stress 19 1.6 CDPKs in der abiotischen Stress- und ABA-Antwort
21 1.7 Zielsetzungen 27 2 Material und Methoden 28 2.1 Material 28 2.1.1
Chemikalien 28 2.1.2 Verwendete Enzyme, Proteine, Peptide, Antikörper und
Größenstandards 28 2.1.3 Verwendetet Medien 29 2.1.4 Verwendete E.coli-Stämme
29 2.1.5 Verwendete Pflanzenlinien 30 2.1.6 Vektoren und Plasmide 31 2.1.7
Verwendete Programme 35 2.2 Methoden 35 2.2.1 Methoden zum Arbeiten mit A.
thaliana-Pflanzen 35 2.2.1.1 Anzucht und Selektion von A. thaliana-Pflanzen 35
2.2.1.2 A. thaliana-Samen-Sterilisierung 36 2.2.1.3 Stressversuche an A.
thaliana-Keimlingen 36 2.2.1.4 Herstellung von Polyethylenglycol- (PEG-)
Platten nach (Verslues et al. 2006) 37 2.2.2 Mikrobiologische Methoden 37
2.2.2.1 Anzucht von E. coli 37 2.2.2.2 Hitzeschocktransformation
chemokompetenter E.coli-Zellen (DH10B/BL21 DE3) 37 2.2.2.3 Herstellung
chemokompetenter E.coli-Zellen (DH10B/BL21 DE3) 38 2.2.3 Molekularbiologische
Methoden – Nukleinsäuren 38 2.2.3.1 E.coli-Plasmid-DNA-Minipräparation 38
2.2.3.2 E.coli-Plasmid-DNA-Maxipräparation 38 2.2.3.3 DNA-Isolierung aus A.
thaliana nach (Edwards et al. 1991) 38 2.2.3.4 RNA-Isolierung aus A. thaliana
mit der Trizol-Methode nach (Chomczynski und Sacchi 2006) 39 2.2.3.5 DNase-
Behandlung der RNA 39 2.2.3.6 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR) 40 2.2.3.7 Polymerase Chain Reaction (PCR) nach (Mullis et al. 1992)
40 2.2.3.8 Agarose-Gelelektrophorese 41 2.2.3.9 DNA-Extraktion aus
Agarosegelen 41 2.2.3.10 Aufreinigung eines PCR-Produkts 41 2.2.3.11
Quantifizierung der Nukleinsäurekonzentration 41 2.2.4 Klonierung 41 2.2.4.1
Restriktionsverdau von Plasmiden 44 2.2.4.2 Dephosphorylierung 44 2.2.4.3
Ligation 45 2.2.4.4 Mutagenese-PCR nach (Weiner et al. 1994) 45 2.2.4.5
Sequenzierung der DNA 46 2.2.5 Molekulare Methoden – Protein 46 2.2.5.1
Proteinexpression in E. coli unter Verwendung eines IPTG-induzierbaren Systems
46 2.2.5.2 Zellaufschluss von E. coli 46 2.2.5.3 GST-Aufreinigung 47 2.2.5.4
Aufreinigung der CPK21-CLD für „Surface Plasma Resonance“- (SPR-)
Interaktionsanalysen 48 2.2.5.4.1 Aufreinigung His-markierter Proteine 49
2.2.5.4.2 Entfernung der His-Markierung durch die Protease Thrombin 49
2.2.5.4.3 Phenylsepharose 50 2.2.5.4.4 Umpufferung über eine Entsalzungssäule
50 2.2.5.4.5 Protein-Aufkonzentrierung durch Größenausschlussfiltration 50
2.2.5.4.6 Proteinkonzentrationsbestimmung 51 2.2.5.5 Transiente Protein-
Expression in A. thaliana-Protoplasten 51 2.2.5.6 pRD29B::LUC-
Expressionsmessungen nach Yoo et al. (2007) 53 2.2.5.7 Zellaufschluss von A.
thaliana-Protoplasten und Strep-Affinitätschromatografie 53 2.2.5.8
Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 54 2.2.5.9 Coomassie-
Färbung 55 2.2.5.10 Färbungen „Sypro® Ruby“ und „ProQ® Diamond“ 55 2.2.5.11
Western-Blot 55 2.2.5.12 Immunodetektion 55 2.2.5.13 Färbung von Membranen mit
dem Ponceaus-S-Farbstoff 57 2.2.6 Enzymaktivitätsmessungen 58 2.2.6.1
Kinaseaktivitätsmessungen 58 2.2.7 Interaktionsstudien 58 2.2.7.1
SLAC1-CPK23-Coimmunpräzipitationen 58 2.2.7.2 LerCDPK-
ABI2-Coimmunpräzipitationen 59 2.2.7.3 „Surface Plasmon Resonance”- (SPR-)
Interaktionsstudien 60 2.2.7.3.1 Immobilisierung des Peptids 21P1 60 2.2.7.3.2
Messung des SPR-Signals 60 3 Ergebnisse 61 3.1 Analyse der in vivo Funktion
der CPK21 und CPK23 61 3.1.1 Charakterisierung der T-DNA-Insertionslinien der
CPK21 und CPK23 61 3.1.1.1 Bestimmung des T-DNA-Insertionsortes für die T-DNA-
Linie mit Insertionsereignis in CPK21 (SALK_029412) 61 3.1.1.2 Bestimmung des
T-DNA-Insertionsortes für die T-DNA-Linie mit Insertionsereignis in CPK23
(SALK_007958) 63 3.1.1.3 Untersuchungen eines Resttranskripts in der
cpk23-1-Mutante 64 3.1.2 Phänotypische Untersuchung der cpk21-1 unter
hyperosmotischen Stressbedingungen 65 3.1.3 Analyse der abiotischen Stress-
und ABA-abhängigen Markergene in cpk21-1 und cpk23-1 67 3.1.4 Untersuchung der
Funktion der CPK21 und CPK23 in der ABA-Signaltransduktion 70 3.1.4.1 Analyse
des Einflusses der CPK21 und CPK23 auf die Expression von RD29B 70 3.1.4.1.1
Untersuchung der RD29B-Expression in cpk21-1- und cpk23-1-Protoplasten 71
3.1.4.1.2 Untersuchung des Einflusses von CPK23 auf die ABA- und
RCAR1-abhängige RD29B-Expression 72 3.1.4.1.3 Untersuchung des Einflusses der
CPK21 auf die ABA- und RCAR1-abhängige RD29B-Expression 73 3.1.4.2
Interaktions- und regulatorische Analyse mit anderen Komponenten der ABA-
Signaltransduktion 75 3.1.4.2.1 Interaktionsstudien einer CPK23 homologen
LerCDPK mit ABI2 76 3.1.4.2.2 Slow- (langsame) Anionenkanäle als in vivo
Interaktoren der CPK21 und CPK23 77 3.1.4.2.3 Interaktionsanalysen der CPK23
mit NT-SLAC1 78 3.1.4.2.4 Nachweis der in vivo Phosphorylierung von NT-SLAH3
durch CPK21 79 3.2 Biochemische Charakterisierung der CPK21 und CPK23 81 3.2.1
Ca2+-Abhängigkeit der in vitro Kinaseaktivität der CPK23 und CPK21 81 3.2.2
CPK23 eine Ca2+-abhängige Kinase? Sequenzvergleich der CPK21 und CPK23 82
3.2.2.1 Vergleich der calmodulinähnlichen Domäne 83 3.2.2.2 Vergleich des
Pseudosubstratsegments 84 3.2.3 In dieser Arbeit verwendete CPK21- und
CPK23-Chimären und Punktmutationskonstrukte 87 3.2.4 Ca2+-abhängige
Kinaseaktivität-CPK23::21-CLD-Chimäre und Punktmutanten in der EF-Hand 1 und
dem Pseudosubstratsegment 88 3.2.5 Untersuchung des Ca2+-abhängigen
Laufverhaltens in der SDS-Gelelektrophorese 91 3.2.5.1 Analyse des
Ca2+-abhängigen Laufverhaltens im SDS-Gel einer CPK21-inaktiven Variante und
der CPK21-CLD 92 3.2.5.2 Untersuchung des Ca2+-abhängigen Laufverhaltens im
SDS-Gel der CPK23:21-CLD-Chimäre 93 3.2.6 Untersuchung des (Auto )
Phosphorylierungszustands in E.coli-exprimierten CPK23-Varianten 93 3.2.7
Analyse der CPK23-Varianten mit degenerierten EF-Hand-Motiven 95 3.2.8
Ca2+-abhängige intramolekulare Interaktion zwischen dem Pseudosubstratsegment
und der CLD der CPK21 97 4 Diskussion 100 4.1 Aktivierung von CDPKs in
Abhängigkeit von Ca2+ 100 4.1.1 Ist CPK23 eine Ca2+-abhängige Kinase? 100
4.1.1.1 Die Ca2+-Bindemotive der CPK23 100 4.1.1.2 Die EF-Hand 1 als
Ca2+-Bindemotiv in der CPK23 100 4.1.1.3 CPK23-CLD 102 4.1.1.4 Funktionalität
der CPK23-EF-Hände 103 4.1.2 Pseudosubstratsegment 105 4.1.2.1
Pseudosubstratsegment der CPK23 105 4.1.2.2 Interaktionsstudien zum
Pseudosubstratsegment und zur CLD 106 4.1.3 Regulierung der CPK23-Aktivität
durch Phosphorylierung 108 4.1.3.1 Regulierung der CPK23-Aktivität durch
Phosphorylierung des Pseudosubstratsegments 109 4.2 CPK21 und CPK23 als
Regulatoren der abiotischen Stress-Signal- transduktion 110 4.2.1
Funktionalität eines Resttranskripts in den Linien cpk21-1 und cpk23-1 110
4.2.2 cpk21-1 zeigt eine erhöhte Toleranz gegenüber osmotischem Stress 111
4.2.3 cpk21-1 und cpk23-1 zeigen eine erhöhte Expression ABA- und abiotischer
Stress-abhängiger Markergene 113 4.2.4 CPK21 und CPK23 in der ABA-
Signaltransduktion 116 4.2.4.1 CPK21 und CPK23 als negative Regulatoren in der
ABA- und RCAR1-abhängigen RD29B-Expression 116 4.2.5 Teilweise überschneidende
Funktionen der CPK21 und CPK23 118 4.2.6 Interaktions- und regulatorische
Analyse mit anderen Komponenten der ABA-Signaltransduktion 119 4.2.6.1 PP2Cs
als Interaktoren der CPK21 und CPK23 119 4.2.6.2 Anionenkanäle als in vivo
Substrate der CPK21 und CPK23 120 4.2.6.3 Unterschiedliche Funktionen der
CPK21 und CPK23 in der ABA-Signaltransduktion in unterschiedlichen Zelltypen
122 5 Zusammenfassung / Summary 124 5.1 Zusammenfassung 124 5.2 Summary 125 6
Quellen 127 7 Anhang XVII
dc.description.abstract
Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) dekodieren entwicklungs- und
umweltbedingte Ca2+-Signale, übersetzen sie in Phosphorylierungsereignisse und
aktivieren dadurch Signalkaskaden. In dieser Dissertation wird die Funktion
der homologen Arabidopsis thaliana CDPKs CPK21 und CPK23 in der abiotischen
Stress- und Abscisinsäure- (ABA ) Signaltransduktion untersucht. Hierbei wird
erstmals für dieselben CDPKs sowohl die schnelle ABA-Signaltransduktion in
Protoplasten als auch die Langzeitadaption an abiotischem Stress unter
Verwendung stabiler transgener Linien untersucht. In phänotypischen
Wachstumsversuchen der T-DNA-Insertionslinie cpk21-1 (SALK_029412) konnte eine
erhöhte osmotische Stressresistenz beobachtet werden. Diese Versuche zeigten
den Einfluss des Fehlens einer funktionellen CPK21 auf die Langzeitadaption
der Pflanzenentwicklung an osmotische Stressbedingungen. Desweiteren konnte
selbst unter Kontrollbedingungen eine erhöhte Expression einiger abiotischer
Stress- und ABA-abhängiger Markergene in den T-DNA-Insertionslinien cpk21-1
und cpk23-1 (SALK_007958) beobachtet werden. Die Analyse der in vivo Funktion
der CPK23 und CPK21 in der schnellen ABA-abhängige Signaltransduktion erfolgte
transient in A. thaliana-Blatt-Mesophyll-Protoplasten unter Verwendung eines
pRD29B::LUC- (Luciferase-) Konstrukts als molekularbiologischen Marker. Die
CPK21 und CPK23 konnten als negative Regulatoren der schnellen abiotischen
Stress- und ABA-Signaltransduktion identifiziert werden. Desweiteren konnten
in in vivo Interaktionsstudien und regulatorische Analysen zusätzliche
Komponenten der ABA-Signaltransduktion wie z.B. Anionenkanäle als in vivo
Substrate oder Interaktoren identifiziert werden. Einen weiteren Schwerpunkt
dieser Arbeit stellte die Ca2+-Abhängigkeit der CPK21- und
CPK23-Kinaseaktivität dar. Die CPK23 zeigte im Gegensatz zur CPK21 eine
Ca2+-unabhängige Aktivität. Damit scheint die CPK23 die erste beschriebene
Ca2+-unabhängige CDPK, darzustellen. Der Vergleich zweier so homologer Kinasen
ermöglicht es, Unterschiede in der biochemischen Aktivität mit Aminosäure-
Sequenzunterschieden zu korrelieren. Zwei wichtige Aminosäurevariationen
konnten identifiziert werden: I. Die Ca2+-Bindeschleife der CPK23-EF-Hand 1
entspricht nicht dem EF-Hand-Konsensusmotiv; daher wurde die Ca2+-spezifische
Bindestelle durch Punktmutation der EF-Hand (Q393E) restauriert. II. Im
Pseudosubstratsegment der CPK23 befindet sich an der entsprechenden Position
eines in Pflanzen hochkonservierten Isoleuzins ein Serin (S362). Für die
beiden Mutanten CPK23Q393E und CPK23S362I zeigte sich eine im Vergleich zum
nativen Protein erhöhte Ca2+-Abhängigkeit. Die beiden Aminosäuren konnten als
für die Ca2+-Regulation der Kinaseaktivität essenziell identifiziert werden.
Damit gelang es erstmals, die Funktion von CDPKs vom molekularen Mechanismus,
ausgehend, durch die Charakterisierung einzelner wichtiger Aminosäuren, bis
hin zur in vivo Regulation der schnellen und adaptiven Stressantwort zu
beschreiben.
de
dc.description.abstract
Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are implicated in the perception of
stress- and developmental stimuli-induced changes in Ca2+ concentrations and
their respective translation into specific phosphorylation patterns for signal
transduction. This PhD thesis investigates the role of the homologous
Arabidopsis thaliana CDPKs CPK21 and CPK23 in abiotic stress and abscisic acid
(ABA) signal transduction. For the first time CDPKs were analysed in parallel
for rapid ABA signal transduction using transient expression in protoplasts
and for long term adaption to abiotic stress using stable transgenic lines.
Seedlings of the T-DNA insertion line cpk21-1 (SALK_029412) were shown to be
more tolerant to growth under hyper-osmotic conditions. This indicates the
influence of CPK21 on the regulation of long term adaption to osmotic stress.
Even in the absence of any exposure to stress, an increased abiotic stress
response with respect to abiotic stress and also ABA-induced marker gene
expression was demonstrated for both T-DNA insertion lines cpk21-1 and cpk23-1
(SALK_007958). The role of the in vivo function of CPK21 and CPK23 in rapid
ABA signal transduction was addressed in A. thaliana leaf mesophyl protoplasts
using pRD29B::LUC as molecular read-out. These assays allowed the
identification of CPK21 and CPK23 as negative regulators of the rapid abiotic
stress and ABA signal transduction. In in vivo interaction and phosphorylation
studies with components of the ABA signal transduction pathways for e.g. anion
channels, in vivo targets and interactors could be identified. A second key
aspect is the Ca2+-dependent regulation of CPK21 and CPK23 protein kinase
activity. No Ca2+-dependency of CPK23 kinase activity could be observed in
contrast to a high Ca2+-dependency for CPK21 kinase activity. Thus CPK23 could
be identified as the first Ca2+ independent CDPK, leading to the question of
amino acid variations in highly homologous proteins. Two crucial amino acids
could be identified in CPK23: I. -Q393- The Ca2+-binding loop of the EF-hand1
of CPK23 did not match the Ca2+-binding consensus motif. Therefore a more
specific Ca2+-binding site via reversion of Q393 to E was generated. II.
-S362- Via comparison of the pseudosubstrate segment of CPKs serine (S362) in
CPK23 could be identified in place of the CPK consensus isoleucin. Mutation of
this serine to isoleucine and the amino acid exchange in EF-hand 1 form Q393
to E resulted to a regain of Ca2+-dependency of kinase activity. For the first
time CDPKs could be characterised starting from enzyme activity, based on
single crucial amino acids, leading to their function in the rapid ABA signal
transduction and in the long term adaption to abiotic stress.
en
dc.format.extent
XXXV, 137 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
signal transduction
dc.subject
abiotic stress
dc.subject
calcium-dependent regulation
dc.subject
kinase activity
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Regulation und Funktion von AtCPK21 und AtCPK23 in der schnellen ABA-
Signaltransduktion und adaptiven abiotischen Stressantwort
dc.contributor.inspector
Prof. Wolfgang Schuster
dc.contributor.inspector
Dr. Claus-Peter Witte
dc.contributor.inspector
Dr. Britta Ehlert
dc.contributor.firstReferee
Prof.Tina Romeis
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2012-08-31
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000044492-0
dc.title.translated
Regulation and function of AtCPK21 and AtCPK23 in abiotic stress response and
ABA signal transduction
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000044492
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012799
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open access