Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) dekodieren entwicklungs- und umweltbedingte Ca2+-Signale, übersetzen sie in Phosphorylierungsereignisse und aktivieren dadurch Signalkaskaden. In dieser Dissertation wird die Funktion der homologen Arabidopsis thaliana CDPKs CPK21 und CPK23 in der abiotischen Stress- und Abscisinsäure- (ABA ) Signaltransduktion untersucht. Hierbei wird erstmals für dieselben CDPKs sowohl die schnelle ABA-Signaltransduktion in Protoplasten als auch die Langzeitadaption an abiotischem Stress unter Verwendung stabiler transgener Linien untersucht. In phänotypischen Wachstumsversuchen der T-DNA-Insertionslinie cpk21-1 (SALK_029412) konnte eine erhöhte osmotische Stressresistenz beobachtet werden. Diese Versuche zeigten den Einfluss des Fehlens einer funktionellen CPK21 auf die Langzeitadaption der Pflanzenentwicklung an osmotische Stressbedingungen. Desweiteren konnte selbst unter Kontrollbedingungen eine erhöhte Expression einiger abiotischer Stress- und ABA-abhängiger Markergene in den T-DNA-Insertionslinien cpk21-1 und cpk23-1 (SALK_007958) beobachtet werden. Die Analyse der in vivo Funktion der CPK23 und CPK21 in der schnellen ABA-abhängige Signaltransduktion erfolgte transient in A. thaliana-Blatt-Mesophyll-Protoplasten unter Verwendung eines pRD29B::LUC- (Luciferase-) Konstrukts als molekularbiologischen Marker. Die CPK21 und CPK23 konnten als negative Regulatoren der schnellen abiotischen Stress- und ABA-Signaltransduktion identifiziert werden. Desweiteren konnten in in vivo Interaktionsstudien und regulatorische Analysen zusätzliche Komponenten der ABA-Signaltransduktion wie z.B. Anionenkanäle als in vivo Substrate oder Interaktoren identifiziert werden. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit stellte die Ca2+-Abhängigkeit der CPK21- und CPK23-Kinaseaktivität dar. Die CPK23 zeigte im Gegensatz zur CPK21 eine Ca2+-unabhängige Aktivität. Damit scheint die CPK23 die erste beschriebene Ca2+-unabhängige CDPK, darzustellen. Der Vergleich zweier so homologer Kinasen ermöglicht es, Unterschiede in der biochemischen Aktivität mit Aminosäure- Sequenzunterschieden zu korrelieren. Zwei wichtige Aminosäurevariationen konnten identifiziert werden: I. Die Ca2+-Bindeschleife der CPK23-EF-Hand 1 entspricht nicht dem EF-Hand-Konsensusmotiv; daher wurde die Ca2+-spezifische Bindestelle durch Punktmutation der EF-Hand (Q393E) restauriert. II. Im Pseudosubstratsegment der CPK23 befindet sich an der entsprechenden Position eines in Pflanzen hochkonservierten Isoleuzins ein Serin (S362). Für die beiden Mutanten CPK23Q393E und CPK23S362I zeigte sich eine im Vergleich zum nativen Protein erhöhte Ca2+-Abhängigkeit. Die beiden Aminosäuren konnten als für die Ca2+-Regulation der Kinaseaktivität essenziell identifiziert werden. Damit gelang es erstmals, die Funktion von CDPKs vom molekularen Mechanismus, ausgehend, durch die Charakterisierung einzelner wichtiger Aminosäuren, bis hin zur in vivo Regulation der schnellen und adaptiven Stressantwort zu beschreiben.
Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are implicated in the perception of stress- and developmental stimuli-induced changes in Ca2+ concentrations and their respective translation into specific phosphorylation patterns for signal transduction. This PhD thesis investigates the role of the homologous Arabidopsis thaliana CDPKs CPK21 and CPK23 in abiotic stress and abscisic acid (ABA) signal transduction. For the first time CDPKs were analysed in parallel for rapid ABA signal transduction using transient expression in protoplasts and for long term adaption to abiotic stress using stable transgenic lines. Seedlings of the T-DNA insertion line cpk21-1 (SALK_029412) were shown to be more tolerant to growth under hyper-osmotic conditions. This indicates the influence of CPK21 on the regulation of long term adaption to osmotic stress. Even in the absence of any exposure to stress, an increased abiotic stress response with respect to abiotic stress and also ABA-induced marker gene expression was demonstrated for both T-DNA insertion lines cpk21-1 and cpk23-1 (SALK_007958). The role of the in vivo function of CPK21 and CPK23 in rapid ABA signal transduction was addressed in A. thaliana leaf mesophyl protoplasts using pRD29B::LUC as molecular read-out. These assays allowed the identification of CPK21 and CPK23 as negative regulators of the rapid abiotic stress and ABA signal transduction. In in vivo interaction and phosphorylation studies with components of the ABA signal transduction pathways for e.g. anion channels, in vivo targets and interactors could be identified. A second key aspect is the Ca2+-dependent regulation of CPK21 and CPK23 protein kinase activity. No Ca2+-dependency of CPK23 kinase activity could be observed in contrast to a high Ca2+-dependency for CPK21 kinase activity. Thus CPK23 could be identified as the first Ca2+ independent CDPK, leading to the question of amino acid variations in highly homologous proteins. Two crucial amino acids could be identified in CPK23: I. -Q393- The Ca2+-binding loop of the EF-hand1 of CPK23 did not match the Ca2+-binding consensus motif. Therefore a more specific Ca2+-binding site via reversion of Q393 to E was generated. II. -S362- Via comparison of the pseudosubstrate segment of CPKs serine (S362) in CPK23 could be identified in place of the CPK consensus isoleucin. Mutation of this serine to isoleucine and the amino acid exchange in EF-hand 1 form Q393 to E resulted to a regain of Ca2+-dependency of kinase activity. For the first time CDPKs could be characterised starting from enzyme activity, based on single crucial amino acids, leading to their function in the rapid ABA signal transduction and in the long term adaption to abiotic stress.
