Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein that physically links the cytoskeleton to the ECM through the dystrophin-associated protein complex (DAPC), thereby providing sarcolemmal stability. Mutations in the dystrophin encoding DMD gene cause the severe X-linked disorder Duchenne muscular dystrophy (DMD). DMD is characterized by progressive muscle wasting and fibrosis, impairing notably skeletal and heart muscle function as well as to various degrees cognitive, visual and gastrointestinal function due to missing dystrophin in the respective tissues. In this work a novel DmdEGFP reporter mouse that expresses a fluorescently labelled endogenous dystrophin – EGFP fusion protein was generated and characterized. The protein was tagged at the C-terminus that is present in the most dystrophin isoforms. To date, no dystrophin reporter mice exist, thus imaging is only possible by indirect antibody-mediated processing ex vivo. For the generation of transgenic mice a targeting vector containing a FLAG-EGFP coding sequence inserted in-frame after the last modified exon 79 of the murine Dmd gene was constructed. Following the EGFP sequence a loxP flanked neomycin cassette was inserted into the 3’UTR. The vector was used for modification of the X-chromosomal Dmd locus in embryonic stem cells and germline transmission of the modified allele. After removal of the neomycin selection cassette in the F1 generation DmdEGFP mice and their wildtype littermates were characterized. Strong natural EGFP expression was observed in skeletal and smooth muscles, heart, brain and the eye and EGFP fluorescence co-localized with dystrophin at all sites suggesting proper tagging of the major dystrophin isoforms. In skeletal muscle, dystrophin as well as other proteins of the DAPC were expressed in normal quantity at correct sarcolemmal/subsarcolemmal localization. Skeletal muscle maintained normal tissue architecture, suggesting a correct function of the dystrophin-EGFP fusion protein. Isolated myofibers as well as satellite-cell derived myotubes expressed EGFP in vitro. Thus, the novel dystrophin reporter mouse provides a valuable tool for direct visualization of dystrophin expression. Furthermore, the model can be used to investigate dystrophin re- expression in vivo or ex vivo after various gene therapy protocols that are aimed at the reestablishment of the dystrophin open reading frame or in naturally occurring revertant fibers.
Dystrophin ist ein zytoplasmatisches Protein, welches wesentlich für den Aufbau des Dystrophin-assoziierten Proteinkomplexes (DAPC) ist. Der Komplex vernetzt das Zytoskeleton mit der extrazellulären Matrix, wodurch das Dystrophin entscheidend zur Stabilisierung des Sarkolemmas und zur Erhaltung der Muskelfaserintegrität während der Muskelkontraktion beiträgt. Mutationen im Dystrophin kodierenden DMD Gen, verursachen die schwere X-chromosomal vererbte Muskeldystrophie Duchenne (DMD). DMD ist gekennzeichnet durch eine fortschreitende Muskeldegeneration und Fibrose, welche die Skelettmuskel- und Herzmuskelfunktion beeinträchtigt. Darüber hinaus sind zu einem gewissen Grad auch kognitive, visuelle und gastrointestinale Funktionen gestört. Ursache für die Krankheit ist das Fehlen des Dystrophin-Proteins in dem jeweiligen Gewebe. In der vorliegenden Arbeit habe ich ein neues Mausmodel, die DmdEGFP Reportermaus, generiert und charakterisiert. Das Model ist gekennzeichnet durch die Expression eines Fluoreszenz-markierten Dystrophin-EGFP Fusionsproteins. Bislang existiert keine Reportermaus für Dystrophin, so dass die Visualisierung der Dystrophin-Expression bisher nur mittels indirekter Antikörperfärbung ex vivo möglich war. Für die Herstellung der transgenen Maus habe ich einen Targeting-Vektor entwickelt, welcher die FLAG-EGFP Gensequenz downstream des letzten Exons (Exon 79) des Dmd Gens der Maus einfügt. Weiter 3‘ downstream habe ich noch eine loxP flankierte Neomycin Selektionskassette eingebracht, welche später nach homologer Rekombination und Blastozysteninjektion durch Verpaarung der F1-Generation mit einer ubiquitär exprimierenden Cre-Maus wieder entfernt werden konnte. Zum Nachweis der Dystrophin Expression und zum Ausschluss einer möglichen Induktion einer Dystrophinopathie durch das EGFP-markierte Fusionsprotein habe ich die DmdEGFP Mäuse und ihre wildtyp Wurfgeschwister histologisch charakterisiert. Dabei konnte ich eine starke natürliche EGFP Fluoreszenz sowohl in den Skelett- Herz-, und glatten Muskeln, als auch im Gehirn und Auge beobachten. Das EGFP- Signal kolokalisierte mit dem immunhistologisch nachgewiesenen Expressionsmuster des Dystrophins, was die korrekte Markierung der Mehrheit der Dystrophin Isoformen bestätigt. Im Skelettmuskel wurden Dystrophin sowie andere Proteine des DAPCs in normaler Menge am Sarkolemma exprimiert. Der Muskel bewahrte seine normale Gewebestruktur, was die korrekte Funktion des Dystrophin-EGFP Fusionsproteins impliziert. Sowohl isolierte Muskelfasern als auch aus Satellitenzellen generierte Myotuben exprimierten das EGFP- Fusionsprotein in vitro. Somit ist die neue Reportermaus ein nützliches und wertvolles Model für die direkte Visualizierung der Dystrophin Expession. Darüber hinaus kann man das Model benutzen, um in oder ex vivo die Dystrophin- Reexpression nach Gentherapie oder in natürlich vorkommenden „revertant fibers“ zu studieren.
