The development of novel drug target deconvolution methodologies is a growing need in the pharmaceutical industry. The increased regulatory scrutiny demands that better and safer medicines reach the consumer market and, for that, a comprehensive characterization of the multiple targets and off-targets of the drug early in the development process is a key success factor. Chemical proteomics advances have provided the tools to study drug mechanisms of action in a more direct and unbiased way than target-based screening strategies, by analyzing the effects in the context of the full proteome from the target cell or tissue of interest. Capture compound mass spectrometry (CCMS) is a robust and versatile chemical proteomics technique due to the original design of the probes. Capture compounds are trifunctional molecules that traditionally carry a selectivity function, consisting of the small molecule under study, attached to a scaffold bearing a tag, such as a fluorophore or biotin, and a UV- reactive moiety protruding from the central core that covalently binds the probe to the target protein. Although capture compounds are very efficient and specific in targeting of even low affinity and low abundant targets, their use has been limited so far to working with cellular lysates or targeting cell- surface proteins. The main objective of this work was to advance CCMS to implement and optimize workflows for the use of newly designed permeable capture compounds to profile small molecule drugs in living cells, where the targets are in their unaltered natural environment. Bio-orthogonal “click” chemistry provides the prerequisite for the use of permeable capture compounds bearing only the selectivity and reactivity functions, and a small “clickable” chemical handle to bind and cross-link the targets in living cells and afterwards specifically attach the sorting/detection function by a controlled chemical click reaction such as the copper-assisted azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Initial reaction parameters for the click reaction were tested using a clickable cAMP capture compound in a solution of recombinant PKARI. The optimization efforts in copper ion concentration, ligand nature, duration and pH of the reaction, azide and alkyne concentrations yielded substantial improvements from the starting point. Capturing PKA subunits from cell lysates with the optimized parameters proved to be possible to use this workflow but the results were not fully satisfactory. A capture compound with a non-natural selectivity function was used to further develop target identification in cell lysates and living cells using the new click reaction. The kinase inhibitor dasatinib was profiled using this strategy and bona fide targets were successfully identified using the clickable compound. ABL, BCR and SRC were specifically identified in lysates and CSK, a known dasatinib binder, was positively identified for the first time by chemical proteomics in living cells. The newly established click workflow allowed to better characterize phenobarbital, a drug that was developed as an anti-epileptic but elicits unexplained hepatocarcinogenic effects in some species. The results of capture experiments suggest that this small molecule interacts with several proteins in the epidermal growth factor receptor signaling pathway and that the primary target could be the transcription factor YBX1, and not the receptor itself as it was suggested recently. A cell-based assay was developed to validate this finding but was not further explored due to time constraints. In summary, the strategy to identify small molecule targets in living cells using capture compounds and bio-orthogonal chemo-selective ligation methods was successfully established. This method provides the tools for a better characterization of the target profiles of drugs and still has potential to be further innovated.
Die Entwicklung neuer Methoden zur Dekonvolution der Profile von Zielproteinen für pharmazeutische Wirkstoffe ist von wachsender Bedeutung für die Pharmaindustrie. Eine umfassende Charakterisierung der Zielproteine einschließlich sogenannter „Off-targets“ ist ein Schlüsselfaktor um bessere und sicherere Medikamente auf den Markt zu bringen. Fortschritte in der Chemischen Proteomanalyse bieten Werkzeuge für die direktere und bezüglich der Zielproteine hypothese-freie Untersuchung der Wirkungsmechanismen von Medikamenten, bei der die Bindung im Kontext des vollständigen Proteoms der Zielzelle oder des Zielgewebes untersucht wird. Die Capture Compound Massenspektrometrie (CCMS)-Technologie ist eine robuste und sehr flexibel einsetzbare Technik in der chemischen Proteomanalyse. Capture Compounds sind trifunktionelle Moleküle, die in ihrer klassischen Version eine Selektivitätsfunktion tragen, die dem zu untersuchenden Kleinmolekül-Wirkstoff entspricht, die mit einer Gerüststruktur verbunden ist, welche außerdem eine Isolierungsfunktion sowie eine UV-aktivierbare Reaktivitätsfunktion für die kovalente Verbrückung zum gebundenen Zielprotein enthält. Obwohl Capture Compounds sehr effizient und spezifisch Zielproteine bindet, war ihr Einsatz bislang wegen fehlender Permeabilität auf Zell-Lysate bzw. auf Oberflächenproteine lebender Zellen beschränkt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Weiterentwicklung der CCMS-Technologie durch Implementierung und Optimierung des Einsatzes permeabler Capture Compounds neuartigen Designs zur Profilierung von Kleinmolekül-Wirkstoffen in lebenden Zellen, in denen die Zielproteine in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen. Bio-orthogonale „Click“-Chemie bietet die Voraussetzung für den Einsatz permeabler Capture Compounds, die lediglich die Selektivitätsfunktion, die Reaktivitätsfunktion sowie eine kleine, „Click“-fähige chemische Gruppe enthalten. Bindung und Verbrückung zu den Zielproteinen kann in den lebenden Zellen erfolgen, und erst danach die Sortier-/Detektionsfunktion in einer kontrollierten chemischen „Click“-Reaktion (wie z.B. die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, CuAAC) angebracht werden. Initiale Reaktionsbedingungen für die „Click“-Reaktion wurden mit einer Capture Compound mit cAMP als Selektivitätsfunktion in einer Lösung einer rekombinanten PKARI getestet. Die Optimierung der Reaktion brachten substantielle Verbesserungen in der Reaktionsausbeute im Vergleich zu den Startbedingungen. Um die Identifizierung von Zielproteinen in Zell-Lysaten und lebenden Zellen unter Verwendung der „Click“-Reaktion weiter zu entwickeln, wurde eine Capture Compound mit einer anderen Selektivitätsfunktion verwendet. Das Kinaseinhibitor-Medikament Dasatinib wurde mit dieser Strategie profiliert. Die bona fide Zielproteine ABL, BCR, und SRC wurden spezifisch in Zell-Lysaten und zum ersten Mal CSK mit chemischer Proteomanalyse in lebenden Zellen identifiziert. Der neu etablierte methodische Arbeitsablauf ermöglichte es, Phenobarbital besser zu charakterisieren, weil es in einigen Spezies hepatocarcinogen wirkt. Die Ergebnisse der Capture-Experimente legen nahe, dass der primäre Binder der Transkriptionsfaktor YBX1 sein könnte. Insgesamt konnte die Strategie, Zielproteine von Kleinmolekül-Wirkstoffen in lebenden Zellen mit Hilfe neuartiger Capture Compounds und bio-orthogonaler chemo-selektiver Ligation erfolgreich etabliert werden. Diese Methode bietet ein Werkzeug für die bessere Charakterisierung der Zielprotein-Profile von Medikamenten und hat das Potential, noch weiter verbessert zu werden.
