In dieser Arbeit wurde Filamin A als neuer intrazellulärer Interaktionspartner von CEACAM1-L identifiziert. Um die funktionelle Auswirkung der Interaktion von CEACAM1-L und Filamin A zu untersuchen, wurde ein humanes Melanom- Zellsystem etabliert, dass die Filamin A- und CEACAM1-L-negativen wt-M2-Zellen und die daraus durch Transfektion entstandenen Filamin A-exprimierenden A7-Zellen zur Grundlage hatte. Beide Zelllinien wurden mit CEACAM1-L transfiziert, so dass die Zelllinien M2-CC1 und A7-CC1 entstanden. Filamin A und CEACAM1-L lagen also jeweils einzeln exprimiert und koexprimiert vor. Es konnte in Transwell-Migrations- und -Invasions-Assays sowie in Monolayer- Wundheilungs-Assays gezeigt werden, dass die alleinige Expression von CEACAM1-L die Zellstreuung und die Migration erhöhte, aber keinen Einfluss auf die Invasion hatte. Die alleinige Expression von Filamin A hatte keinen Einfluss auf die Zellstreuung, erhöhte aber die Migration und die Invasion. CEACAM1 und Filamin A schienen verschiedene Mechanismen für ihre pro- migratorische Funktion zu nutzen, da sie unterschiedliche Auswirkungen auf die Organisation des Aktinzytoskeletts und die Phosphorylierung von Integrin- abhängigen Adhäsionen hatten. Die Koexpression der beiden Proteine bewirkte die völlige Inhibition der Zellstreuung sowie eine starke Reduktion der Migration und der Invasion. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung von CEACAM1-L und Filamin reguliert ist und dass die Bindung von CEACAM1-L und Filamin A dessen Interaktion mit der kleinen GTPase RalA stört. Der zweite identifizierte Interaktionspartner von CEACAM1-L ist das Poldip2. Es wurde ein Poldip2-spezifischer Antikörper hergestellt und Koimmunpräzipitationen zeigten, dass CEACAM1-L und Poldip2 auch in vivo interagieren. Es konnte eine zytoplasmatische und nukleäre Lokalisation von Poldip2 in endothelialen und epithelialen Zellen gezeigt werden. In indirekten Immunfluoreszenzen wurde gezeigt, dass die intrazelluläre Lokalisation von Poldip2 in NBT-II-Zellen durch die Zelldichte und durch die Behandlung mit EGF beeinflussbar war. Für strukturelle und funktionelle Untersuchungen von Mitgliedern der CEA-Familie wurden eine Reihe verschiedener CEACAM-Fc-Konstrukte kloniert und exprimiert. Dazu wurden die extrazellulären Domänen der humanen CEACAMs 1, 5, 6 und 8 sowie des Ratten-CEACAM1 mit der konstanten Region der schweren Kette eines humanen IgG fusioniert.
Here, filamin A was identified as a novel cytoplasmic CEACAM1-L interacting protein. For functional studies on the CEACAM1-L-filamin A interaction, a human melanoma cell system was established. The CEACAM1-L- und filamin A-negative M2 cells und the derived, filamin A-rescued A7 cells were both transfected with CEACAM1-L cDNA. The resulting cell lines were named M2-CC1 und A7-CC1. Thus, the cell system included CEACAM1-L- und filamin A-single transfectants und one cotransfectant. In monolayer wound-healing assays and in transwell migration and invasion assays CEACAM1-L was shown to enhance cell scattering und migration when expressed solely, while it had no effect on invasion. Filamin A enhanced migration und invasion when expressed solely but had no effect on cell scattering. CEACAM1-L und filamin A seemed to use different pathways to exert their promigratory functions, since they diversely influenced the organization of the actin cytoskeleton and the phosphorylation of integrin-based adhesions. In contrast, CEACAM1-L-filamin A-double- transfectants exhibited virtually no cell scattering und showed a decreased motility und a reduced filamin A induced invasivity. Additionally, binding of CEACAM1-L to filamin A was dynamic and interfered with the filamin A-RalA interaction. The second interaction partner of CEACAM1-L identified here, was poldip2. A poldip2-specific polyclonal antibody was produced and the interaction of CEACAM1-L and poldip2 was confirmed by coimmunoprecipitation. Cellular fractionation revealed a cytoplasmic und nuclear localisation of poldip2 in endothelial and epithelial cells. The intracellular localization of poldip2 in NBT-II cells was affected by confluency und by the treatment with EGF, as shown by indirect immunofluorescence. Several CEACAM-Fc fusion constructs were cloned and expressed to be used in functional and structural studies on members of the CEA-family. The extracellular domains of rat CEACAM1 and human CEACAMs 1, 5, 6 and 8 were fused to the constant region of a human IgG heavy chain.
