EPR-Methoden zur Strukturbestimmung von Proteinen mit dipolar gekoppelten Spinzentren Hochfeld-EPR und ELDOR (Elektron-Elektron Doppelresonanz) in Verbindung mit ortsgerichteter Spinmarkierung bilden eine wichtiges Werkzeug in der Bestimmung von Proteinstrukturen. In dieser Arbeit werden methodische Entwicklungen vorgestellt, welche die Strukturbestimmung von Proteinen mit dipolar gekoppelten Spinzentren breiter einsetzbar machen. Dies soll an drei verschiedenen Beispielen dargestellt werden. In doppelt spinmarkierten de novo Peptiden wurden Abstand und die relative Orientierung der beiden Spinlabel bestimmt, welche rigid mit dem Proteinrückgrat verbunden sind. Daraus konnte die Sekundärstruktur bestimmt werden, insbesondere kann aber auch zwischen unterschiedlichen Helixtypen (alpha-, 310-, pi-Helix) unterschieden werden, welche sich in Abhängigkeit von der Umgebung des Peptids ausbilden. 5'-Nucleotidase ist ein Enzym mit zwei Untereinheiten, welche während des katalytischen Prozesses gegeneinander rotieren. Aus der Röntgenkristallographie ist die Struktur beider Untereinheiten bekannt, jedoch hängt deren Drehwinkel gegeneinandern von den Kristallisationsbedingungen ab. Durch EPR-Messungen wurde die Konformation des Enzyms in Lösung ohne und in Substratgegenwart ermittelt und so gezeigt, daß mit Substratbindung eine Konformationsänderung eintritt. Mittels gepulsten ELDOR-Untersuchungen wurde die dipolare Kopplung zwischen einem [3Fe-4S]+-Cluster und einem [NiFe]-Zentrum in einer Hydrogenase bestimmt. Die experimentell ermittelte Spin-Spin Wechselwirkung weicht von dem erwarteten Wert für je einen Punkt-Dipol in den Zentren der beiden Metallcluster ab, deren Abstand aus Röntgenstrukturuntersuchungen bekannt ist. Die experimentellen Daten konnten mit einem erweiterten Spinkopplungsmodell beschrieben werden, welches die Spinkopplung im [3Fe-4S]+-Cluster berücksichtigt. Damit wurde gezeigt, daß das ELDOR-Experiment genutzt werden kann, um die Spin-Spin Wechselwirkung innerhalb eines Metallclusters zu analysieren.
EPR-Methods for Structure Determination of Proteins with Dipolar Coupled Spincenters The combination of pulsed high field-EPR and ELDOR (electron-electron double resonance) with site-directed spin-labelling has proven to be an important tool to determine protein structures. Here we present three novel applications of this approach. In double labelled de novo synthesized peptides the distance and relative orientation of the spin-labels was determined. Analysis of the orientation was possible by using spin-labels fixed to the protein backbone. Thereby the secondary structure could be determined, especially different helix types (alpha-, 310-, pi-helix) could be distinguished, which are formed depending on the solvent environment. 5'-Nucleotidase is an enzyme with two subunits which are supposed to rotate against each other in the catalytic process. From x-ray crystallography the structure of the individual subunits is known, their relative orientation however depends on the crystallisation conditions. EPR experiments revealed the conformation of the enzyme in solution without and with substrate and could demonstrate conformational changes upon binding of the substrate. By pulsed ELDOR experiments the dipolar coupling between a [3Fe-4S]+ cluster and a [NiFe] center was determined. The experimental dipolar spin-spin interaction deviates from the value expected for two point-dipoles located at the centers of the metal clusters which distance is known from x-ray crystallography. An extended spin-coupling model accounting for the spin coupling within the [3Fe-4S]+ cluster yields the observed coupling under the assumption of a particular magnetic coupling scheme for the three Fe ions. These results demonstrate that pulsed ELDOR can be used to gain insight into the inner structure of a multi-nuclear metal cluster.
