The present study approached the identification of molecular pathways involved in the cardiac developmental process by addressing first a high-throughput gene expression analysis in human and secondary the distinct functional characterisation of a new potential key player, namely, DPF3, in model organism. The gene expression profile showed disease-specific molecular portraits of Tetralogy of Fallot (TOF) and Ventricular Septal Defects (VSD) as well as genes involved in the biomechanical adaptation process due to pressure overload. The combination of statistical analysis and the study design enabled the separation of secondary adaptation-specific expression patterns from effects attributable to primary cardiac dysdevelopment. In addition, a chamber-specific genome-wide expression portrait of the normal human heart could be provided. Moreover, a global molecular portrait of the normal and diseased heart using a genome-wide approach including functionally unknown genes was obtained. In the following a selection of those genes was subjected to mouse whole mount in situ hybridisations in key stages of cardiogenesis. The most appealing cardiac expression pattern was obtained for Dpf3, a potential transcription factor, which was therefore selected for further functional analysis. DPF3 belongs to the D4 family, which has been assigned to the nervous system. DPF3/1 and DPF3/2 revealed a significant upregulation in TOF malformations versus normal hearts. During mouse embryogenesis, Dpf3/1 showed expression in the cardiac crescent in E7.5 embryos. Moreover, Dpf3/1 was specifically expressed in the tubular heart, youngest somites and presomitic mesoderm of E8.5 embryos. At E9.5, Dpf3 expression was detected in the looping heart and the somites, as well as the developing brain and liver. From E10.5 onwards expression of Dpf3/1 in the cardiac region decreased, whereas expression in the developing nervous system and liver was getting more prominent. Chicken in situ hybridisations of Dpf3 displayed expression in the sinoatrial region of the developing heart. Bioinformatic analysis of the DPF3 promoter exhibited a RAREs/DR1 DNA binding site recognised by retinoic acid receptor (RAR/RXR) heterodimers as well as COUPTF/RXR complexes. Thus, to gain a better insight of the DPF3 in the retinoic acid signalling pathway, cultured chicken embryos were subjected to all-trans-retinoic acid treatment. Administration of an excess of all-trans-retinoic acid resulted in an increased expression in the sinoatrial region of the looping heart and a diminished expression in the neural tube suggesting a tissue specific regulation of DPF3 mediated by retinoic acid receptors and COUPTFs in cardiogenesis. Taken together the results of microarray analysis using human samples in combination with model organism for distinct functional studies opens a new window to understand cardiac adaptation and development.
Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Identifizierung von molekularen Signalwegen, die an der Herzentwicklung beteiligt sind. Dazu wurde zunächst im Hochdurchsatz eine Genexpressionsanalyse an humanen Proben durchgeführt und darüber hinaus DPF3, ein neues potentielles Schlüsselprotein in Modellorganismen funktionell charakterisiert. Die Genexpressionsprofile zeigten krankheitspezifische molekulare Portraits des Morbus Fallot (TOF) und des Ventrikelseptumdefekts (VSD). Ausserdem konnten Gene identifiziert werden, die an der mechanischen Anpassung an eine erhöhte Druckbelastung beteiligt sind. Das gewählte Studiendesign ermöglichte die getrennte Betrachtung von Expressionsmustern spezifisch für sekundäre Anpassungsvorgänge und Genprofilen, die aus der primären kardialen Fehlentwicklung resultieren. Des weiteren wurde ein kammerspezifisches genomweites Expressionsportrait von normalen humanen Herzen erstellt. Aus den Expressionsprofilen wurden differentiell exprimierte, bisher uncharakterisierte Gene ausgewählt und im folgenden in situ Hybridisierungen an Mausembryonen in Schlüsselstadien der Herzentwicklung durchgeführt. Das auffälligste Herz-Expressionsmuster zeigte der potentielle Transkriptionsfaktor Dpf3, der daher weiter funktionell charakterisiert wurde. DPF3 gehört zur D4 Familie, deren Bedeutung bisher nur im Nervensystem bekannt ist. Die Spleißformen DPF3/1 und DPF3/2 waren in TOF fehlgebildeten Herzen signifikant stärker exprimiert als in normalen Herzproben. Während der Herzentwicklung der Maus wurde in E7.5 Embryonen eine starke Expression von Dpf3/1 im halbmondförmigen Herzfeld nachgewiesen. Darüber hinaus war Dpf3/1 in E8.5 Embryonen besonders im tubulären Herz, den jüngsten Somiten und dem präsomitischen Mesoderm exprimiert. Im Stadium E9.5, konnte Dpf3 Expression in der Herzschleife und in den Somiten, sowie im sich entwickelnden Gehirn und Leber detektiert werden. Vom Stadium E10.5 an zeigte sich eine verstärkte Expression im sich entwickelnden Nervensystem und in der Leber. In Huhn in-situ Hybridisierungen konnte die Expression von Dpf3 in der sinoatrialen Region des sich entwickelnden Herzens detektiert werden. Die bioinformatische Analyse des DPF3-Promoters zeigte eine RAREs/DR1 DNA- Bindungsstelle, die von Retinsäure-Rezeptor Heterodimeren (RAR/RXR) und COUPTF/RXR Komplexen erkannt wird. Um die potentielle Bedeutung von DPF3 in der Retinsäure-Signalkaskade zu untersuchen wurden Huhnembryonen mit einem Überschuss an all-trans-Retinsäure behandelt. Dies resultierte in einer erhöhten Expression von Dpf3 in der sinoatrialen Region der Herzschleife und einer verminderten Expression im Neuralrohr, was eine durch Retinsäure und COUPTFs beeinflusste gewebespezifische Regulation von DPF3 vermuten lässt. Zufammenfassend lässt sich sagen, dass die hier gezeigte Kombination von humanen Microarray-Ergebnissen mit funktionellen Studien an Modellorganismen neue Einblicke in Herzentwicklung und kardiale Anpassungsvorgänge liefert.
