L-Typ-Ca2+-Kanäle sind Proteinkomplexe, die in der Regulation der Muskelkontraktion eine wesentlich Rolle spielen. Das Schaltverhalten und die Regulation spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle werden durch die Interaktion zwischen der ionenleitenden a 1-Untereinheit und der akzessorischen b -Untereinheit bestimmt. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der b L-Typ-Ca2+-Kanäle sind Proteinkomplexe, die in der Regulation der Muskelkontraktion eine wesentlich Rolle spielen. Das Schaltverhalten und die Regulation spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle werden durch die Interaktion zwischen der ionenleitenden a1-Untereinheit und der akzessorischen b-Untereinheit bestimmt. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der b2a-Untereinheit durch die Modulation der glattmuskulären a1C-b-Untereinheit auf Einzelkanalebene zu analysieren. Weiterhin sollte die funktionelle Rolle der a1-b -Interaktion mittels eines synthetischen Peptids (AID-Peptid), das die Sequenz der a1-Interaktionsdomäne (AID) imitiert, studiert werden. In HEK-Zellen führte die Koexpression der b2a-Untereinheit zu einer signifikanten Erhöhung der Offenwahrscheinlichkeit (Po) der a1C-b-Kanäle. Diese erhöhte Po der a1C-b·b2a-Kanäle war mit dem Auftreten von sehr langlebigen Kanalöffnungen (t >10ms) verbunden. Bindungsversuche mit dem AID-Peptid zeigten eine spezifische Affinität zur nativen b2-Untereinheit. Die Applikation des AID-Peptids auf die zytoplasmatische Seite von Inside-Out- Patches verursachte eine drastische Verringerung der Po der a1C-b·b2a-Kanäle. Das AID-Peptid übte weder einen Effekt auf die Funktion von a1C-b-Kanälen aus, noch wurde mit einem Kontroll-Peptid ein verändertes Schaltverhalten der a1C-b ·b2a-Kanäle beobachtet. Die Ergebnisse demonstrieren den Einfluss der b2-Untereinheit auf das schnelle Schaltverhalten der a1C-b-Kanäle, wobei die AID ein mögliches Target für die Kanalmodulation darstellt.
L-type Ca2+channels are protein complexes that play a critical role in the regulation of muscle contractility. Gating as well as regulation of voltage- dependent Ca2+channels is for a large part determined by the interaction between ion-conducting a 1 and b subunits.
An aim of this study was to analyze modulation of the smooth-muscle Ca2+channel a 1C-b subunit by the accessory b 2a subunit at single-channel level. In addition, the functional role of the a 1-b interaction was studied using an synthetic peptide (AID-peptide) that corresponds to the sequence of the a 1 interaction domain (AID). Ca2+ channels derived by coexpression of a 1C-b and b 2a subunits in HEK cells exhibited a significantly higher open probability (Po) than a 1C-b channels. High Po gating of a 1C-b·b 2a channels was associated with promotion of long-lasting openings (t >10ms). Binding experiments with the AID-peptide showed a specific affinity to the native b 2 subunit. Administration of the AID-peptide to the cytoplasmic side of inside- out patches induced a rapid decline of Po of a 1C-b·b 2 channels. The AID- peptide did not modify a 1C-b channel function in absence of expressed b 2a subunit, and the scrambled control peptide failed to affect a 1C-b ·b 2a channels. The results demonstrate that the b 2 subunit controls fast gating of a 1C-b channels, and suggest the a 1-b interaction domain as a possible target of modulation of the channel.
Recently it was shown that ahnak, a 700 kDa phosphoprotein, is linked to cardiac L-type Ca2+ channel via the b 2 subunit by coprecipitation experiments. So far, the molecular details of this interaction has not been studied. Herein, the interaction was defined between b 2 subunit and ahnak. Overlay binding assays as well as sedimantation equilibrium analysis with glutathione-S-transferase fusion proteins revealed specific, high-affinity b 2a binding for the most C-terminal region of ahnak (ahnak-C2, aa 5262-5643). Within the b 2a protein, two binding sites for ahnak-C2 with differing affinities (Kd1=53 nM, Kd2=212 nM) were determined. The high affinity site localizes in the C-terminal (aa 195-606, Kd=55 nM) b 2a portion, while the binding site of lower affinity resides in the N-terminal (aa 1-200, Kd=328 nM) portion of b 2a subunit. Protein-protein interaction between ahnak-C2 and b subunits was corroborated by in vitro pull-down assay with native Ca2+ channels, since ahnak-C2 affinity beads recovered cardiac b 2 subunits and skeletal muscle b 1a subunits together with the corresponding a 1C and a 1S proteins. These results underline the significance of b subunits in tethering the a 1 subunit of L-type Ca2+ channels to ahnak.
