dc.contributor.author
Schneider, Patrick
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:38:50Z
dc.date.available
2001-06-25T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10772
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14970
dc.description
Titelblatt
Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 1
2\. Material und Methoden 21
3\. Ergebnisse 63
4\. Diskussion 111
5\. Zusammenfassung 121
6\. Literatur 123
7\. Appendix 128
dc.description.abstract
Zusammenfassung
In dieser Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob die rätselhafte,
nichttranslatierte, oncofötale humane H19-RNA spezifische Wechselwirkungen mit
Proteinen eingeht. Denn seit längerer Zeit wird die Möglichkeit diskutiert,
dass das H19-Gen lediglich der begrenzenden Regulierung des reziprok geprägten
Wachstumsfaktors IGF2 dient und die RNA als Genprodukt funktionslos und
entbehrlich ist. Neuere Untersuchungen deuten jedoch an, dass diese RNA eine
konservierte Sekundärstruktur aufweist und die Sequenz unter einem
stabilisierenden Druck steht. Sie tritt in proliferierendem Gewebe bei
einsetzender Differenzierung auf, und zwar temporal und gewebespezifisch
parallel zum IGF2, dessen mRNA-Niveau durch die H19-RNA negativ beeinflusst zu
werden scheint. Die in Zellkultur gezeigte Unterdrückung der Proliferation
durch die Produktion der H19-RNA legte eine Aktivität der RNA als
Tumorsuppressor nahe, das Auftreten in einer Reihe von Tumoren spricht jedoch
dagegen. Von Anfang an wurde die Assoziation der RNA mit Proteinen postuliert,
jedoch keines identifiziert. Die Funktion dieser strukturierten RNA könnte
aber gerade in der Wechselwirkung mit Proteinen zu suchen sein.
Zur Identifikation von Bindungsproteinen musste die RNA zunächst in größeren
Mengen herstellbar sein. Daher wurde die cDNA mittels RACE-PCR kloniert, um
die RNA mittels in-vitro-Transkription herstellen zu können. Die Hälfte der
Klone trug am 5´-Ende eine rätselhafte, palindromische Consensus-Sequenz. Alle
Klone enthielten PCR-bedingte Punktmutationen. Der Versuch, vollständige und
mutationsfreie Klone aus einer cDNA-Phagenbibliothek zu isolieren, scheiterte.
Ein ausgewählter Arbeitsklon wurde umkloniert, um Zusatzsequenzen an den Enden
der RNA zu minimieren und am 3´-Ende einen poly-A-Schwanz zu generieren. Die
RNA wurde mit verschiedenen Methoden modifiziert und immobilisiert, wobei der
erfolgversprechendste Ansatz die kovalente Bindung an Agarose zur Konstruktion
von Affinitätssäulen war. In Gegenwart von Heparin konnten schließlich
spezifische plazentale Bindungsproteine isoliert und identifiziert werden. Es
handelte sich um PTB, hnRNP K, IMP3 und c-myc-FUSE-BP, wobei PTB und ein
weiteres Mitglied der IMP-Familie (IMP1) durch eine andere Publikation
bestätigt wurden (Runge et al., 2000). H19-Sense und -Antisense scheinen im
Wesentlichen die gleichen Proteine zu binden, was jedoch noch näher untersucht
werden muss. Zukünftig muss die Wirkung der H19-Bindung auf die Aktivität der
Proteine untersucht sowie eventuell vorhandene weitere Bindungspartner
identifiziert werden, um die genaue wachstumsbegrenzende und differenzie-rende
Wirkungsweise der H19-RNA verstehen zu können.
de
dc.description.abstract
Summary
In this work the question was to be pursued whether the enigmantic,
nontranslated oncofetal human H19-RNA interacts specifically with proteins.
For a longer time the possibility has been discussed that the H19 gene serves
only for the limiting regulation of the reciprocally imprinted growth factor
IGF2 and therefore the RNA might be without function and dispensable. However,
later investigations indicate, that this RNA has a conserved secondary
structure and that the sequence is under stabilizing pressure. The RNA occurs
in proliferating tissue during differen-tiation in temporal and tissue-
specific parallelism to IGF2, whose mRNA level seems to be negatively
influenced by the H19 RNA. The suppression of proliferation shown in cell
culture through the production of the H19 RNA suggested a role as a tumor
suppressor, whereas the occurrance in several tumors did not. From the
beginning there was evidence that the RNA is associated with proteins, but
none of them has been identified. The function of this structured RNA might be
defined just through the interaction with proteins.
For the identification of binding proteins the RNA must be producable in
larger quantities. Therefore the cDNA was cloned using RACE-PCR in order to
produce the RNA via in vitro transcription. Half of the obtained clones
carried an enigmatic consenus sequence at the very 5´-end. All of the clones
carried PCR-related point mutations. The attempt to isolate a complete and
mutationless clone from a cDNA phage library failed. A chosen working clone
was subcloned in order to minimize the additional sequences at the ends of the
RNA and to generate a poly-A-tail at the 3´-end. The RNA was modified and
immobilized using different methods but the most promising was the covalent
binding to agarose for the construction of affinity columns. Finally, in the
presence of heparin, specific placental binding proteins could be isolated and
identified. These were PTB, hnRNP K, IMP3 and c-myc-FUSE-BP, of these PTP and
another member of the IMP-family (IMP1) were confirmed by another publication
(Runge et al., 2000). H19 sense and antisense RNA seem to bind essentially the
same proteins which still has to be investigated in more detail. For the
future the effect of the H19 binding on the activity of the proteins has to be
investigated together with the identification of possible additional ligands
in order to fully under-stand the growth-inhibiting and differentiating mode
of action of the H19 RNA.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
binding protein
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Klonierung und Untersuchung der rätselhaften geprägten H19-RNA auf mögliche
Proteinliganden
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker A. Erdmann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Dr. Manfred Schweiger
dc.date.accepted
2001-03-22
dc.date.embargoEnd
2001-07-04
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2001001016
dc.title.translated
Cloning and Investigation of the enigmatic imprinted H19-RNA for possible
Protein Ligands
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000411
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2001/101/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000411
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free
dcterms.accessRights.openaire
open access