Microglial cells are the resident immune cells of the brain and are important for fight against microorganisms, clearance of damaged tissue and scar formation. If the brain gets injured microglial cells transform from a resting to an activated stage. The physiological changes that accompany with microglia activation are not fully understood in the adult brain, because so far adequate models to study the cells are misssing. Microglia were investigated mainly in cell culture prepared from neonatal rodends. A few recent studies on microglia from adult animals advert that these cells differ in their physiological properties compared to cultured microglia from neonatals. Therefore I investigated the physiology of microglia cells of the adult brain in the present work. First I characterized cultured microglia cells from the adult brain by patch clamp technique and compared them to microglial cells from neonatal mice. Following properties could be identifyed: (1) Adult cultured microglia cells exhibit in general less inward and outward currents then cultured microglial cells from neonatal brains. (2) The current amplitudes were increasing culturing time. (3) The amplitude and conductance of inward currents in unstimmulated microglia was age dependent, whereas outward currents did not differ. (4) Adult microglia from distant brain regions, namely cerebral cortex and corpus callosum did not differ in their current profiles. (5) Upon mimicing bacterial infection by stimulation with LPS, adult microglia were able to induce outward currents. Unexpectedly microglia from juvenilles where not able to develop outward currents upon LPS stimulation. In vitro studies show that microglia express a variety of neurotransmitter and neuropeptide receptors which are linked to Ca2+ dependent pathways. This signaling molecules were found to modulate important microglia functions. In the second part of this work I introduce a new approach which allowed me to extent calcium measurements to microglia in the brain tissue environment of adult mice. A retrovirus encoding for eGFP or a calcium sensor protein (GCaMP2) was injected into the cortex of mice two days after microglial proliferation was stimulated by a stab wound. 3, 6, 21 and 42 days after the stab wound injury acute brain slices were prepared. Characterization of the eGFP positive cells in the side of injury by patch clamp experiments and by antibody staining identified them as highly activated microglial cells at 3 and 6 days. EGFP positive cells at day 42 showed properties of resting microglia. Upon GCaMP2 expression transient intracellular Ca2+ increase in response to of ATP, endothelin-1, substance P, histamine and serotonin application were recorded. The fluorescence amplitude to ATP was higher at day 6 in comparison to all other time points. The responses to all other ligands did not differ significantly between the time points. About half of the microglial cells that responded to ATP also responded to endothelin-1, serotonin and histamine. Only substance P at day 6 showed a complete overlap with the ATP responding microglial population, while at day 42 this population was reduced to 55 %. Adult microglia in the brain slice showed an increased responsiveness to the tested ligands in comparison to cultured microglia from neonatal mice. My studies support the hypothesis that adult microglia differ in their physiology from microglia of neonatal mice. The present results are contributing to the better understanding of brain injury of adults.
Mikrogliazellen sind die Immunzellen des Gehirns und sind für die Verteidigung gegen Mikroorganismen, die Säuberung von zerstörtem Gewebe und für Narbenbildung von Bedeutung. Im Falle einer Gehirnverletzung wechseln Mikroglia von einem ruhenden in einen aktivierten Zustand. Die physiologischen Veränderungen im Gehirn eines Erwachsenen, die mit Mikrogliaaktivierung einhergehen nicht vollständig verstanden, weil geeignete Modelle zum Studium der Zellen fehlen. Mikroglia wurden bisher hauptsächlich in Zellkultur untersucht, welche aus neugeborenen Nagetieren gewonnen wurden. Einige wenige kürzlich angefertigte Untersuchungen an Mikroglia von erwachsenen Tieren weisen darauf hin, dass sich diese Zellen in ihren physiologischen Eigenschaften von kutivierten Mikrogliazellen aus neugebornen Tieren stammend unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit habe ich daher die Physiologie von Mikroglia des Gehirns von erwachsenen Mäusen untersucht. Zunächst habe ich kultivierte Zellen des erwachsenen Gehirns mittels Patch Clamp-Technik untersucht und diese mit Mikrogliazellen von neugebornen Mäusen verglichen. Folgende Eigenschaften könnten dabei identifiziert werden: (1) Erwachsene kultivierte Mikrogliazellen zeigen generell weniger Einwärts- und Auswärtsströme als kultivierte Mikroglia von Gehirnen Neugeborener. (2) Die Stomamplitude war abhängig von der Kultivierungszeit. (3) Die Amplitude und Leitfähigkeit der Einwärtsströme von unstimmulierten Mikrogliazellen war altersabhängig, wärend sich die Auswärtsströme nicht unterschieden. (4) Erwachsene Mikroglia von verschiedenen Gehirnregionen, namentlich cerebraler Kortex und Corpus callsoum unterschieden sich nicht in ihren Stromprofilen. (5) Nach Imitation einer bakteriellen Infektion mittels LPS, waren adulte Mikroglia in der Lage Auswärtströme induzieren. Unerwarteterweise konnten Mikroglia von jugendlichen Mäusen keine Auswärtsströme entwickeln. In vitro- Studien zeigen, dass Mikroglia eine Vielzahl an Neurotransmitter- und Neuropeptid-Rezeptoren exprimieren, welche mit Kalzium abhangigen Signalwegen verbunden sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit stelle ich einen neuen Ansatz vor, welcher mir erlaubt Kalziummessungen an Mikrogliazellen auf das Gehirngewebe von erwachsenen Mäusen auszuweiten. Ein Retrovirus, welcher entweder für eGFP oder das Calciumsensorprotein GCaMP2 codiert, wurde in das Gehirn von Mäusen injeziert, zwei Tage nach dem Mikrogliazellen mittels Stichwundenverletzung zur Proliferation angeregt wurden. 3, 6, 21 und 42 Tage nach Stichwundenverletzung wurden akute Hirnschnitte vorbereitet. Die Charakterisierung der eGFP positiven Zellen nahe der Verletzung mittels Patch Clamp-Experimenten und Antikörperfärbung ergab, dass es sich haupsächlich um aktivierte Mikrogliazellen an Tag 3 und 6 handelte. EGFP positive Zellen an Tag 42 zeigten Eigenschaften von ruhenden Mikrogliazellen. Nachdem GCaMP2 in den Zellen exprimiert wurde konnte ich vorrübergehende intrazelluläre Kalziumerhöhungen als Antwort auf die Applikation von ATP, Endothelin-1, Substanz P, Histamin und Serotonin messen. Die Fluoreszenzamplitude war an Tag 6 im Gegensatz zu allen anderen Zeitpunkten erhöht. Die Antworten der anderen Liganden unterschieden sich nicht zwischen den Zeitpunkten. Ungefähr die Hälfte der Zellen, die auf ATP reagierten, antworteten auch auf Endothelin-1, Serotonin und Histamin. Nur Substanz P zeigte eine komplette Übereinstimmung mit der auf ATP reagierenden Zellpopulation an Tag 6, wärend an Tag 42 nur noch 55% der Zellen reagierten. Erwachsene Mikrogliazellen im Gehirnschnitt zeigten ein erhöhtes Antwortverhalten gegenüber den getesten Liganden im Vergleich zu kultivierten Mikrogliazellen von neugeborenen Mäusen. Meine Untersuchungen unterstützen die Hypothese, dass sich erwachsene Mikroglia in ihrer Physiologie von Mikrogliazellen neugeboerner Mäuse unterscheiden. Die vorliegenden Ergebnisse werden dazu beitragen Gehirnverletzungen von Erwachsenen besser zu verstehen.
