dc.contributor.author
Lim, Theam Soon
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:37:54Z
dc.date.available
2009-09-04T06:06:24.005Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10753
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14951
dc.description.abstract
The main rationale for the titanic flexibility of the immune system to engage
various types of entities deemed foreign by the body is down to the huge
diversity of the antibody repertoire. With the prospective potential of
antibodies in therapy and diagnostics, effective and efficient strategies to
increase in vitro generation of human antibodies have been investigated. The
quality of antibody libraries is influenced by several factors including
antibody formats, display levels, sequence diversity, expression level,
tendency to multimerize, compatibility with in vitro screening, affinity
maturation and ease of format conversion to other antibody formats or display
and selection systems. The aim of the thesis was to investigate different
parameters that contribute to the generation of human antibodies by phage
display. Here, the influence of different antibody scaffolds on display
efficiency and antibody panning were analysed using different Fab Formats. IgG
Fab performed better than IgD Fab with a 8-fold presentation efficiency.
Further, the interchange of V-regions between individual formats and the
influence on binding characteristics was evaluated. From the format conversion
experiments, in between three formats - scFv, IgD Fab and IgG Fab - IgG Fab
was the best format as it showed the lowest decrease in binding
characteristics when converted to the either scFv or IgD Fab. Once the best
interchangeable format for antibody library design was determined, the
amplification procedure to generate an IgG Fab library from human donor
materials was assessed. First, a set of V-gene primers was designed and
evaluated. The primer set was analyzed against V-gene sequences from the
VBASE2 database. The primer set analyzed showed a significant coverage of
known V-gene sequences. 98% coverage of functional and putatively functional
genes were covered. Other parameters effecting the amplification of V-genes
from donor materials were assessed, namely, cDNA generation, polymerase
amplification efficiency as well as the influence of additives for improving
PCR amplification yields. Form the outcome of these studies, a standard
operating procedure could be described allowing efficient amplification of
antibody gene fragments for library generation.
de
dc.description.abstract
Die gigantische Flexibilität des Immunsystems, die es in die Lage versetzt,
verschiedenste Typen von Entitäten angreifen zu können, die als fremd erkannt
werden, liegt in der enormen Diversität des Antikörper-Repertoires begründet.
In Hinblick auf das prospektive Potenzial von Antikörpern in Therapie und
Diagnostik wurden effektivere und effizientere Strategien untersucht, die zur
Verbesserung der in vitro-Erzeugung menschlicher Antikörper führen sollen. Die
Qualität von Antikörper-Bibliotheken wird von verschiedenen Faktoren
beeinflusst, darunter Antikörperformate, “display level”, Sequenzdiversität,
Expressionsstärke, Tendenz zur Multimerbildung, der Kompatibilität mit in
vitro Screening-Verfahren, der Affinitätsreifung und der Leichtigkeit, mit der
Formatkonversionen in andere Antikörperformate oder Display- und
Selektionssysteme möglich sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war,
verschiedene Parameter zu untersuchen, die Einfluss auf die Erzeugung
menschlicher Antikörper durch Phagen-Display haben. Um den Einfluss
verschiedener Antikörpergerüste auf die Effizienz des Displays und die
Antikörpersuche zu untersuchen, wurde zwei unterschiedliche Fab-Formate
untersucht. Im Kontext der beiden untersuchten Fab-Formate, zeigte IgG Fab
eine bessere Leistung als IgD Fab mit einer 8-fach erhöhten Effizienz der
Präsentation. Des weiteren wurde der Austausch von V-Regionen zwischen
individuellen Formaten und deren Einfluss auf die Bindungscharakteristik
untersucht. Unter den drei Formaten – scFv, IgD Fab und IgG Fab – erwies sich
IgG Fab als das geeignetste Format, da es den geringsten Verlust der
Bindungseingeschaft aufwies, wenn es anschließend entweder nach scFv oder IgD
Fab konvertiert wurde. Nachdem das beste Austauschformat für das Antikörper-
Bibliotheksdesign ermittelt war, wurde die Amplifikationsprozedur, die zur
Erzeugung einer IgG Fab-Bibliothek aus menschlichem Spendermaterial verwendet
wurde, untersucht. Zunächst wurde ein Satz an V-Gen-Primern entworfen und
bewertet. Der Primersatz wurde gegen V-Gen-Sequenzen aus der VBASE2-Datenbank
abgeglichen. Insgesamt konnten 98% aller funktionellen und putativ
funktionellen V-Genen mit dem Primersatz abgedeckt werden. Anschließend wurden
weitere Parameter untersucht, die einen Einfluss auf die Amplifikation
menschlicher V-Gene aus Spendermaterial haben, insbesondere die cDNA Synthese,
die Effizienz unterschiedlicher DNA-Polymerasen und Additive hinsichtlich der
PCR-Ausbeute. Aus den Resultaten dieser Vergleiche konnte ein optimiertes
Standard-Protokoll entwickelt werden, das die effiziente Amplifikation von
Antikörpergenfragmenten zur Erzeugung von Bibliotheken erlaubt.
de
dc.format.extent
VI, 181 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
recombinant Antibodies
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Parameters affecting phage display library design for improved generation of
human antibodies
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Markus Wahl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Hans Lehrach
dc.date.accepted
2009-09-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000012576-4
dc.title.translated
Einfluss unterschiedlicher Parameter auf die Erstellung von Phagen-Display-
Bibliotheken hinsichtlich einer verbesserten Erzeugung menschlicher Antikörper
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000012576
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006247
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access