The main rationale for the titanic flexibility of the immune system to engage various types of entities deemed foreign by the body is down to the huge diversity of the antibody repertoire. With the prospective potential of antibodies in therapy and diagnostics, effective and efficient strategies to increase in vitro generation of human antibodies have been investigated. The quality of antibody libraries is influenced by several factors including antibody formats, display levels, sequence diversity, expression level, tendency to multimerize, compatibility with in vitro screening, affinity maturation and ease of format conversion to other antibody formats or display and selection systems. The aim of the thesis was to investigate different parameters that contribute to the generation of human antibodies by phage display. Here, the influence of different antibody scaffolds on display efficiency and antibody panning were analysed using different Fab Formats. IgG Fab performed better than IgD Fab with a 8-fold presentation efficiency. Further, the interchange of V-regions between individual formats and the influence on binding characteristics was evaluated. From the format conversion experiments, in between three formats - scFv, IgD Fab and IgG Fab - IgG Fab was the best format as it showed the lowest decrease in binding characteristics when converted to the either scFv or IgD Fab. Once the best interchangeable format for antibody library design was determined, the amplification procedure to generate an IgG Fab library from human donor materials was assessed. First, a set of V-gene primers was designed and evaluated. The primer set was analyzed against V-gene sequences from the VBASE2 database. The primer set analyzed showed a significant coverage of known V-gene sequences. 98% coverage of functional and putatively functional genes were covered. Other parameters effecting the amplification of V-genes from donor materials were assessed, namely, cDNA generation, polymerase amplification efficiency as well as the influence of additives for improving PCR amplification yields. Form the outcome of these studies, a standard operating procedure could be described allowing efficient amplification of antibody gene fragments for library generation.
Die gigantische Flexibilität des Immunsystems, die es in die Lage versetzt, verschiedenste Typen von Entitäten angreifen zu können, die als fremd erkannt werden, liegt in der enormen Diversität des Antikörper-Repertoires begründet. In Hinblick auf das prospektive Potenzial von Antikörpern in Therapie und Diagnostik wurden effektivere und effizientere Strategien untersucht, die zur Verbesserung der in vitro-Erzeugung menschlicher Antikörper führen sollen. Die Qualität von Antikörper-Bibliotheken wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, darunter Antikörperformate, “display level”, Sequenzdiversität, Expressionsstärke, Tendenz zur Multimerbildung, der Kompatibilität mit in vitro Screening-Verfahren, der Affinitätsreifung und der Leichtigkeit, mit der Formatkonversionen in andere Antikörperformate oder Display- und Selektionssysteme möglich sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, verschiedene Parameter zu untersuchen, die Einfluss auf die Erzeugung menschlicher Antikörper durch Phagen-Display haben. Um den Einfluss verschiedener Antikörpergerüste auf die Effizienz des Displays und die Antikörpersuche zu untersuchen, wurde zwei unterschiedliche Fab-Formate untersucht. Im Kontext der beiden untersuchten Fab-Formate, zeigte IgG Fab eine bessere Leistung als IgD Fab mit einer 8-fach erhöhten Effizienz der Präsentation. Des weiteren wurde der Austausch von V-Regionen zwischen individuellen Formaten und deren Einfluss auf die Bindungscharakteristik untersucht. Unter den drei Formaten – scFv, IgD Fab und IgG Fab – erwies sich IgG Fab als das geeignetste Format, da es den geringsten Verlust der Bindungseingeschaft aufwies, wenn es anschließend entweder nach scFv oder IgD Fab konvertiert wurde. Nachdem das beste Austauschformat für das Antikörper- Bibliotheksdesign ermittelt war, wurde die Amplifikationsprozedur, die zur Erzeugung einer IgG Fab-Bibliothek aus menschlichem Spendermaterial verwendet wurde, untersucht. Zunächst wurde ein Satz an V-Gen-Primern entworfen und bewertet. Der Primersatz wurde gegen V-Gen-Sequenzen aus der VBASE2-Datenbank abgeglichen. Insgesamt konnten 98% aller funktionellen und putativ funktionellen V-Genen mit dem Primersatz abgedeckt werden. Anschließend wurden weitere Parameter untersucht, die einen Einfluss auf die Amplifikation menschlicher V-Gene aus Spendermaterial haben, insbesondere die cDNA Synthese, die Effizienz unterschiedlicher DNA-Polymerasen und Additive hinsichtlich der PCR-Ausbeute. Aus den Resultaten dieser Vergleiche konnte ein optimiertes Standard-Protokoll entwickelt werden, das die effiziente Amplifikation von Antikörpergenfragmenten zur Erzeugung von Bibliotheken erlaubt.