For decades geneticist have been investigating the human genome and revealed that mutations can cause congenital disorders. The current challenge is to distinguish between pathogenic and nonpathogenic mutations to enable precise diagnostic and risk estimation as well as to determine the choice of efficient treatment. Nevertheless, the effect of coding and noncoding mutations is often not predictable. Therefore, mouse models are needed to verify their pathogenicity. For many years it was extremely time consuming to recapitulate human mutations in mice due to enormous cloning efforts. Additionally, structural variations (SVs) of several hundred kbs could not be generated. Now, CRISPR/Cas9 allows rapid genome editing by sequence specific induction of double strand breaks that facilitate structural rearrangements of more than one Mb and also the integration of point mutations. This work shows that CRISPR/Cas9 can be used in murine ESC for rapid recapitulation of human mutations and generation of viable chimeric mice with duplications, deletions and inversions of several hundred kbs or single nucleotide substitutions. Both, introducing of SVs and point mutations are marked by variable efficiency that seem to be caused by locus specific factors. CRISPR/Cas9 was used to generated six mouse models that helped to verify the pathogenicity of Laf4 truncation, Bhlha9 deletion and Shh duplication while the known pathogenicity of Bhlha9 duplication could not been proved. The effect of the duplication of the enhancer hs1428 at the Tbx15 locus and of the Tyr1096Cys mutation in FNDC3A still remains unclear. Intragenic inframe truncation of LAF4 was found in a patients presenting Nievergelt-like syndrome that is characterized by triangular shaped tibia which was recapitulated in mouse by Laf4 truncation while the Laf4-KO mouse was normal suggesting a dominant gain-offunction effect of intragenic Laf4 truncation. BHLHA9 duplications are found in many patient with SHFM or SHFLD. Nevertheless, overexpression of Bhlha9 does not result in SHFM in mouse. Even the recapitulation of a specific patient duplication did not cause any limb abnormalities. Thus, it is assumed that BHLHA9 and/or its interaction network differs between human and mouse. Contrarily, the deletion of Bhlha9 leads to syndactyly as it was already published for mouse and human. SHH duplication was found in a patient with muscle hypertrophy and in another patient with synpolydactyly. The generation of the corresponding duplication in mouse clearly shows that the tandem duplication leads to soft tissue hypertrophy and not synpolydactyly. A duplication of the enhancer hs1428 at the TBX15 locus was found in a case of radial aplasia. In mouse, the heterozygous recapitulation of the mutation did not affect skeletal development. Now, homozygous mice are needed to clarify if the mutation is pathogenic. In a consanguineous family the homozygous Tyr1096Cys mutation in FNDC3A was found to segregate with recessive SHFM. Since functional investigation could not detect any changes, a mouse models was produced that will help to reveal the effect on limb development. The unsuccessful generation of SHFM in mouse by Bhlha9 duplication shows that mouse models do not always recapitulate human physiology and developmental process. Since only disorders with potential regulative pathomechanism could not be reproduced it is likely that inter species difference on the regulative level prevents the emergence of the expected phenotype. Consequently, mouse model can prove the pathogenicity of a mutation but never its insignificance.
Durch Jahrzehntelange Forschung am menschlichen Genom ist inzwischen bekannt, dass Mutationen potentiell Krankheiten verursachen. Für die humangenetische Diagnostik ist es essentiell pathogene von nicht-pathogenen Varianten zu differenzieren. Daher ist es problematisch, dass der Effekt von codierenden und nicht codierenden Mutationen nicht vorhersehbar ist. Um die Pathogenität zu verifizieren werden humane Mutationen in der Maus reproduziert. Dies war bisher jedoch sehr aufwendig und dadurch limitiert, dass Struktur Veränderungen (SVs) von mehreren kbs nicht generiert werden konnten. Das kürzlich entwickelte CRISPR/Cas9 System erlaubt nun durch sequenzspezifische Doppelstrangbrüche die exakte Generierung von großen SVs und Punktmutationen. Diese Arbeit zeigt, dass CRISPR/Cas9 die Generierung von humanen Mutationen wie Deletionen, Duplikationen, Inversionen bzw. Punktmutationen in murinen ESCs ermöglicht, aus denen chimäre Mäuse erzeugt werden. Die Effizienz der Erzeugung von SVs und Punktmutationen hängt jedoch stark von Lokus spezifischen Faktoren ab. Mit CRISPR/Cas9 wurden sechs unterschiedliche Mauslinien erzeugt und die Pathogenität der intragenen LAF4 Deletion, der BHLHA9 Deletion und der SHH Duplikation nachgewiesen. Die bereits bekannte Pathogenität der BHLHA9 Duplikation konnte das Mausmodel nicht bestätigen. Der Effekt der Tyr1096Cys Mutation in FNDC3a und der Duplikation des Enhancers hs1428 am TBX15 Locus ist immer noch unklar. Die intragene inframe-Deletion in LAF4 wurde in einem Patienten mit Nievergelt-ähnlichem Syndrom gefunden. Sowohl der Patient als auch das Mausmodel zeigen die typische dreieckige Verformung der Tibia. Da Laf4-KO keine Extremitätenveränderung verursacht, wird von einem gain-of-function Mechanismus ausgegangen. Aufgrund von zahlreichen klinischen Fällen sind BHLHA9 Duplikationen dafür bekannt SHFM bzw. SHFLD auszulösen. In der Maus haben jedoch weder die Überexpression noch die Duplikation von Bhlha9 einen Effekt auf die Extremitätenentwicklung. Daher wird vermutet, dass die Funktionalität des menschlichen BHLHA9 sich vom murinen Ortholog signifikant unterscheidet. Die Duplikation von SHH wurde in einem Patienten mit Synpolydactyly gefunden wie auch in einem Fall mit Muskelhypertrophy. Das entsprechende Mausmodel zeigt jedoch klar, dass die in- tandem Duplikation zu Hypertrophy von weichem Gewebe und nicht zu Synpolydactyly führt. Die Duplikation des Enhancer hs1428 am TBX15 Locus wurde in einem Patienten mit radialer Aplasie gefunden. Die gleiche heterozygote Mutation hat in der Maus keinen Effekt. Für eine endgültige Beurteilung werden jedoch homozygote Tiere benötigt. Die Missense Mutation Tyr1096Cys in FNDC3A segregiert innerhalb einer konsanguinen Familien mit rezessivem SHFM. Da funktionelle Untersuchungen nicht ausreichten, um die Pathogenität der Mutation zu beurteilen, wurde sie im Mausmodel nachgestellt. Es lässt sich jedoch noch keine abschließende Aussage treffen, weil die Tiere noch zur Homozygotie gezüchtet werden müssen. Obwohl bekannt ist, dass BHLHA9 Duplikationen SHFM erzeugen, konnte dies in der Maus nicht nachgewiesen werden. Dies verdeutlicht, dass die Maus die humane Physiologie und Entwicklung nicht perfekt wiederspiegelt. Da vor allem Mutationen mit einem potentiell regulativen Pathomechanismus in der Maus nicht das menschliche Krankheitsbild reproduzierten, wird angenommen, dass dies vor allem durch Spezies bedingte Unterschiede in der Genregulation verursacht wurde. Folglich ist die Maus ein gutes Model um die Pathogenität von Mutationen nachzuweisen, jedoch nicht um selbige auszuschließen.
