The volume-regulated anion channel (VRAC) is ubiquitously expressed in vertebrate cells and is a key component of the cellular volume regulation machinery. The characteristic current mediated by VRAC termed volume-activated chloride current (ICl,vol) has been first described in the late 1980s, but despite several attempts, the underlying protein(s) could not be identified. A large body of work suggests that in addition to its role in volume regulation, VRAC may be important in various other physiological and pathophysiological processes including cell proliferation and migration, apoptosis, gliotransmission, ischemic brain edema and cancer. A genome-wide siRNA screen identified the plasma membrane protein LRRC8A that is distantly related to pannexins as an essential component of VRAC. Disruption of the LRRC8A gene in mammalian cells led to a loss of endogenous ICl,vol. LRRC8A formed heteromers with the four other LRRC8 family proteins LRRC8B-LRRC8E, which required LRRC8A to reach the plasma membrane. Functional VRACs were only detected in the presence of LRRC8A and at least one other LRRC8 isoform. Kinetics of the characteristic voltage-dependent inactivation of ICl,vol depended on the LRRC8 subunit composition, suggesting that the VRAC pore is formed by LRRC8 heteromers. Regulatory volume decrease (RVD) and swelling-induced efflux of the important cellular osmolyte taurine also required LRRC8 heteromers. A chimeric approach identified part of the first extracellular loop adjacent to the second transmembrane domain of LRRC8 proteins as a major determinant of the differential inactivation properties. Mutation of two amino acid residues, Lys98 and Asp100 in LRRC8A and equivalent residues in LRRC8C and -E, were found to strongly alter kinetics and steady state extent of ICl,vol inactivation. Charge reversal of the conserved Lys98 also led to a reduction of the characteristic I− > Cl− selectivity that was more pronounced when mutations were introduced into both the obligatory LRRC8A and the co-expressed isoform, thus suggesting that this region contributes to the conduction pathway of VRACs, probably forming the extracellular opening of their pore. I conclude that LRRC8 heteromers are the pore-forming entities of a distinct new class of ion channels. Our findings pave the way for further research on the physiological and pathophysiological roles and the structure-function relationship of VRACs.
Der Volumen-regulierte Anionenkanal (volume-regulated anion channel, VRAC) ist ubiqitär exprimiert und stellt eine Schlüsselkomponente der zellulären Maschinerie für Volumenregulation dar. Der charakteristische VRAC-vermittelte Strom, genannt Volumen-aktivierter Chloridstrom (ICl,vol), wurde bereits in den späten 1980er Jahren beschrieben. Das zugrundeliegende Protein konnte jedoch bisher nicht identifiziert werden. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass VRAC neben seiner Rolle in der Volumenregulation ebenfalls bei verschiedenen anderen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen von Bedeutung ist, so zum Beispiel bei der Zellproliferation und -migration, Apoptose, Gliotransmission, Schlaganfall und Krebs. Durch einen genomweiten siRNA-Screen konnte das entfernt mit Pannexinen verwandte Plasmamembranprotein LRRC8A als essentielle Komponente von VRAC identifiziert werden. Deaktivierung des LRRC8A-Gens führte zum Verlust des endogenen ICl,vol. LRRC8A bildete Heteromere mit den vier anderen Proteinen der LRRC8-Familie (LRRC8B-LRRC8E), welche LRRC8A benötigten um zur Plasmamembran zu gelangen. VRAC-Funktionalität konnte nur in Gegenwart von LRRC8A und mindestens einer anderen LRRC8-Isoform nachgewiesen werden. Die Kinetik der charakteristischen spannungsabhängigen Inaktivierung von ICl,vol wurde von der LRRC8-Zusammensetzung bestimmt. Dies legt nahe, dass die VRAC-Pore durch LRRC8-Heteromere gebildet wird. Die regulatorische Zellvolumenreduktion sowie der schwellinduzierte Efflux des wichtigen zellulären Osmolyts Taurin hingen ebenfalls von LRRC8-Heteromeren ab. Ein chimärischer Ansatz wurde gewählt, um molekulare Determinanten der unterschiedlichen Inaktivierungseigenschaften verschiedener VRACs zu identifizieren. Diese konnten bis auf das C-terminale Drittel des ersten extrazellulären Loops von LRRC8-Proteinen eingegrenzt werden. Die Mutation zweier Aminosäurereste in diesem Bereich, Lys98 und Asp100 in LRRC8A und äquivalente Reste in LRRC8C und -E, führte zu stark veränderter Kinetik und Sättigung der Inaktivierung von ICl,vol. Ladungsumkehrende Mutationen des konservierten Lys98 führten zudem zu einer Verringerung der charakteristischen I− > Cl− Selektivität, die größer war wenn Mutationen sowohl in das obligatorische LRRC8A als auch in die koexprimierte LRRC8-Isoform eingeführt wurden. Dies deutet darauf hin, dass dieser Bereich strukturell zur extrazellulären VRAC-Pore beiträgt. Es wird geschlussfolgert, dass LRRC8-Heteromere die porenbildenden Einheiten einer neuen Klasse von Ionenkanälen sind. Unsere Ergebnisse ebnen den Weg für die weitere Erforschung der physiologischen und pathophysiologischen Rollen sowie der Struktur- Funktionsbeziehung von VRACs.
