Axonal branching is a key mechanism to form complex circuits in the mature nervous system. Depending on their functions, axons can branch extensively to send information to their distinct targets and establish a unique pattern of connectivity. However, signaling mechanisms regulating axonal branching during the development of the nervous system are still poorly understood. The cGMP signaling pathway including the secreted C-type natriuretic peptide (CNP), its receptor natriuretic peptide receptor 2 (Npr2) and the cGMP-dependent protein kinase Iα (cGKIα) has been shown to control the bifurcation of DRG (dorsal root ganglion) sensory neurons within the spinal cord. Using mutant mouse models it has been demonstrated that in the absence of one of these components, the sensory axons are unable to bifurcate at the entry zone of the spinal cord. Based on these findings, it is intriguing to ask whether other neuronal subpopulations besides the DRG neurons exist and if they use the above mentioned cGMP signaling pathway to form branches emerging from the bifurcating growth cone. To investigate the role of Npr2-dependent axonal branching in other neural systems than DRG neurons, a genetic strategy was used and two mouse models (Npr2LacZ and Npr2CreERT2) were generated, which allow studies on the expression pattern of Npr2 and its influence on axonal branching of single Npr2-expressing axons in the mouse nervous system. While the Npr2LacZ reporter mouse enabled detailed analysis of the localization of the signaling pathway components, the Npr2CreERT2 mouse is a valuable tool for visualizing single axonal projections after crossing with reporter strains. A prominent Npr2 expression was found not only in the DRG, but also in the cranial sensory ganglia of the developing mouse. Using immunohistochemistry, a co-localization of the receptor Npr2 and the kinase cGKIα was detected in neurons of cranial sensory ganglia. To follow the single projections of sensory axons from cranial sensory ganglia and study their branching behavior, the Npr2CreERT2 mouse was crossed with two different reporter strains (Z/AP and mGFP). After induction of Cre recombinase with tamoxifen or 4-hydroxytamoxifen at embryonic day 9.5 or 10.5, single axonal projections could be visualized at embryonic day 12.5 or 13.5, respectively. This genetic approach uncovered two new aspects about central projections of cranial sensory ganglia: (i) almost all central projections of cranial sensory ganglia bifurcate at the entry zone of the hindbrain and (ii) in the absence of Npr2 the sensory axons lose their bifurcational behavior when entering the hindbrain. Hence, the neurons of all cranial sensory ganglia - similar to DRG neurons - use cGMP signaling to bifurcate as soon as they enter the hindbrain.
Die axonale Verzweigung ist ein wichtiger Mechanismus, um die komplexen Verschaltungen des Nervensystems zu bilden. Je nach ihrer Funktion können sich Axone weitläufig verzweigen, um die Informationen an ihre verschiedenen Ziele zu senden und ein einzigartiges Muster der Verschaltung zu etablieren. Allerdings sind die Signalmechanismen, die die axonale Verzweigung während der Entwicklung des Nervensystems regulieren, noch weitgehend unverstanden. Ein cGMP-Signalweg kontrolliert die Bifurkation der sensorischen DRG-Neurone (Dorsal root ganglia; Spinalganglien) im Rückenmark und besteht aus folgenden Komponenten: dem C-Typ natriuretischen Peptid (CNP), dem natriuretischen Peptid-Rezeptor-2 (Npr2) und der cGMP-abhängigen Proteinkinase I (cGKIα). In Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit einer dieser Komponenten die sensorischen DRG-Neurone an der Eintrittszone des Rückenmarks nicht bifurkieren. Offen ist, ob es neben den DRG-Neuronen andere neuronale Subpopulationen gibt, die den cGMP-Signalweg im Rahmen der axonalen Verzweigung nutzen. Um die Rolle der Npr2-abhängigen axonalen Verzweigung in anderen Systemen als DRG-Neuronen zu untersuchen, wurden zwei transgene knock- in-Mausmodelle (Npr2LacZ und Npr2CreERT2) generiert, die es erlauben, das Expressionsmuster von Npr2 und die axonale Verzweigung einzelner Npr2-exprimierender Axone in der Maus zu studieren. Während die Npr2LacZ- Reportermaus es ermöglichte, eine detaillierte Analyse der Lokalisation der cGMP-Komponenten durchzuführen, stellte die Npr2CreERT2-Maus nach Kreuzung mit Reporter-Stämmen (Z/AP und mGFP) ein wertvolles Werkzeug für die Visualisierung einzelner axonaler Verzweigungen dar. Eine starke Npr2-Expression wurde nicht nur in den DRG-Neuronen gefunden, sondern auch in den kranialen sensorischen Ganglien. In Neuronen der kranialen sensorischen Ganglien wurde immunhistochemisch eine Ko-Expression des Rezeptors Npr2 und der Kinase cGKIα detektiert. Um das Bifurkationsverhalten einzelner Axone der kranialen sensorischen Neurone zu verfolgen, wurde die Npr2CreERT2-Maus mit den zwei Reporter-Stämmen gekreuzt. Nach Induktion der Cre-Rekombinase mit Tamoxifen am embryonalen Tag 9.5 bzw. 10.5 konnten einzelne axonalen Verweigungen am embryonalen Tag 12.5 bzw. 13.5 visualisiert werden. Dieser genetische Ansatz deckte zwei neue Aspekte der axonalen Bifurkation auf: (i) fast alle zentralen Projektionen der kranialen sensorischen Axone verzweigen an der Eingangszone des Hinterhirns und (ii) in Abwesenheit von Npr2 verlieren die sensorischen Axone ihre Fähigkeit beim Eintritt ins Hinterhirn zu bifurkieren. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass die kranialen sensorischen Neurone den cGMP-Signalweg nutzen, um beim Erreichen des Hinterhirns zu bifurkieren.
