Introduction: Autoimmune diseases like SLE are associated with pathogenic antibodies and malignant neoplasms such as multiple myeloma with abnormal PCs. In both cases, pathogenesis can be related to LLPCs, which require a specific microenvironment composed of stromal cells, haematopoietic stem cells and cytokines. MKs constitute an important niche component as major sources of APRIL and IL-6. TPO is the crucial growth factor for MKs and c-mpl, its receptor. Thus, alterations in megakaryopoiesis can change survival conditions for LLPCs in the niche. Our group found an SNP in the crucial TPO binding domain of c-mpl in SLE-prone mice, and the first part of this thesis aimed to find evidence for a similar mutation in SLE patients. The second part evaluated the effect of selected HNCs in co-culture with murine MM cells. Methods: Genomic DNA from 40 SLE patients and 15 healthy donors was submitted for gene sequencing after target DNA was amplified. Cell lysates of megakaryocytes from SLE-prone mice were examined with ELISA for increased Akt phosphorylation downstream of c-mpl. The second part involved co-culture of a murine MM cell line with selected primary HNCs. After determining optimal cell confluence at which MOPCs depend on external growth factors, the number of MKs available for seeding was improved by combination of BM culture, BSA density gradient, staining of surface markers and manual cell separation using magnetic immunobeads. Results: There was no evidence for a corresponding SNP in samples extracted from SLE patients, not sufficient proof for increased activation of Akt downstream signalling. Co-culture of megakaryocytes demonstrated that MKs support growth and survival of MOPC during nutrient deprivation. The same effect was observed for granulocytes, however not to the same extent. It was also confirmed that the expression profile of CD138 is a potential marker of very early apoptosis. Discussion: Results from the co- culture experiments confirm that MKs have a pivotal influence on PC survival. Extraction of sufficient numbers of MKs proved to be the most challenging aspect of these series of experiments and future studies should aim to optimize efficiency of cell recovery further. Granulocytes also showed a positive effect on PC survival; subsequent research should focus on the examination of distinct subpopulations, including eosinophils and basophils. As several factors are involved in the multi-component survival niche, there is a plethora of prospective therapeutic strategies for the treatment of autoimmune or malignant diseases linked with LLPCs.
Einleitung: Autoimmunerkrankungen wie SLE sind durch pathogene Antikörper und bösartige Neubildungen wie das multiple Myelom durch abnormale PCs charakterisiert, deren Persistenz auf langlebige Plasmazellen zurückgeführt werden kann. Letztere benötigen ein spezifisches Milieu aus Stromazellen, hämatopoetischen Stammzellen und Zytokinen. MKs stellen eine wichtige Komponente dieser Überlebensnische dar. TPO ist der essenzielle Wachstumsfaktor für MKs und c-mpl sein Rezeptor. Veränderungen in der Megakaryopoese können die Überlebensbedingungen für LLPCs in der Nische beeinflussen. Unsere Arbeitsgruppe hat einen SNP in der essenziellen Bindungsdomäne von c-mpl in einem SLE Mausmodell gefunden und der erste Teil dieser Arbeit beabsichtigt, eine ähnliche Mutation in SLE Patienten zu finden. Der zweite Teil beurteilt den Effekt von HNCs in Co-Kultur mit murinen Plasmozytomzellen. Methodik: Genomische DNA von 40 SLE Patienten wurde isoliert, sequenziert und mit DNA von 15 gesunden Probanden verglichen. MKs aus einem SLE Mausmodell wurden anhand von ELISA auf erhöhte Akt Phosphorylierung downstream von c-mpl untersucht. Im Folgenden wurden murine MM Zellen mit ausgewählten HNCs kultiviert. Nach Bestimmung der optimalen Zelldichte wurde die Anzahl verfügbarer MKs durch Knochenmarkskultur, BSA Dichte Gradienten, Färbung von Zelltypmarkern und magnetischer Zelltrennung optimiert. Ergebnisse: Es gab keinen Anhalt für einen entsprechenden SNP in den gewonnenen Proben, eine vermehrte Aktivierung der Akt Signalkaskade konnte nicht eindeutig belegt werden. Co-Kultur von MKs zeigte, dass diese Wachstum und insbesondere Überleben von MOPCs unter suboptimalen Bedingungen unterstützen. Ein ähnlicher Effekt wurde auch für Granulozyten beobachtet. Des Weiteren bestätigte sich auch die Rolle von CD138 als möglichen Indikator für sehr frühe Apoptose. Diskussion: Die Ergebnisse der Co-Kulturen bestätigten, dass MKs einen bedeutenden Einfluss auf das Überleben von Plasmazellen haben. Die Isolation von MKs in ausreichenden Zahlen war eines der anspruchsvollsten Aspekte dieser Arbeit und sollte in zukünftigen Studien weiter optimiert werden. Granulozyten zeigten ebenso einen positiven Effekt, nachfolgende Arbeiten sollten sich auch auf Unterpopulationen wie Eosinophile oder Basophile konzentrieren. Da mehrere Faktoren die Überlebensnische beeinflussen, gibt es eine Fülle an möglichen neuen Optionen für die Behandlung von LLPC-assoziierten autoimmunen oder neoplastischen Erkrankungen.
