Escherichia coli ist ein gram-negatives Enterobakterium, das sowohl innerhalb eines Wirtes als auch im Freien existieren kann. Die meisten E. coli K-12 Stämme kodieren für 29 GGDEF/EAL-Domänen Proteine, die im Allgemeinen Diguanylatzyklase- bzw. Phosphodiesterase-Aktivitäten besitzen und das in Bakterien ubiquitär vorkommende Signalmolekül c-di-GMP synthetisieren bzw. abbauen. Generell steuert c-di-GMP den Übergang von einer planktonischen zu einer adhäsiven Lebensweise von Bakterien. Vier der GGDEF/EAL-Domänen Proteine von E. coli sind jedoch stark degeneriert und haben statt der enzymatischen Aktivität alternative Funktionen im Laufe der Evolution erworben. Das YcgF- Protein von E. coli repräsentiert ein degeneriertes EAL-Domänen Protein, das mittels der N-terminalen BLUF-Domäne Blaulichtsignale wahrnimmt. YcgF, der MerR-ähnliche Regulator YcgE und die kleinen Proteine YcgZ-YmgABC bilden ein komplexes Blaulicht-kontrolliertes Netzwerk in E. coli. Das Ziel dieser Dissertationsstudie war es, die molekulare und die physiologische Funktion dieses Blaulichtsignaltransduktionssystems im Kontext der Biofilmbildung unter Berücksichtigung evolutionärer Aspekte aufzuklären. Während YcgF in anderen Bakterien eine konservierte EAL-Domäne aufweist und z. B. in Klebsiella pneumoniae als eine Blaulicht-regulierte Phosphodiesterase aktiv ist, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass YcgF von E. coli seine Fähigkeit das Signalmolekül c-di-GMP abzubauen oder zu binden aufgegeben hat und nun als direkter anti-Repressor agiert. Dabei interagiert es mit dem MerR-ähnlichen Protein YcgE und verhindert in Abhängigkeit von Blaulicht die Bindung dieses Repressors an seine Operator-DNA. Dies führt zu erhöhter Expression des an die ycgE-ycgF Region angrenzenden σS-abhängigen ycgZ-ymgABC-Operons, wobei die ycgE-ycgF-ycgZ-ymgA-ymgB-Region eine in diversen Enterobakterien konservierte funktionale Einheit darstellt. In dieser Arbeit erzielte Ergebnisse zur Funktion der YcgE/YcgF-abhängigen kleinen Proteine verdeutlichen, dass YmgA und YmgB das komplexe RcsDBC-Phosphotransfer System, das wichtige Prozesse der Biofilmreifung in Enterobakterien reguliert, aktivieren und dadurch u. a. zu erhöhter Expression der Biofilmmatrix Kolansäure und zu geringeren Synthese der adhäsiven Curli-Fasern führen. Dabei bilden YcgZ, YmgA, YmgB einen Komplex, der vermittelt durch YmgB mit der Histidin-Kinase-Domäne von RcsC interagiert und möglicherweise den Phosphotransfer zwischen den Komponenten des Rcs-Systems beeinflusst. Separat von diesem Komplex interagiert auch YmgC mit der Kinase-Domäne von RcsC. Somit agieren die kleinen Proteine unter der Kontrolle des anti-Repressors YcgF und des MerR-ähnlichen Regulators YcgE als Connektoren, die das YcgF/YcgE-Netzwerk mit dem RcsDBC-System verbinden und auf diese Weise das durch das Rcs-System wahrnehmbare Signalspektrum erweitern. Insgesamt wird aus dieser Studie deutlich, dass YcgF sich im Laufe der Evolution aus einer aktiven Blaulicht-regulierten Phosphodiesterase zu einem anti-Repressor Protein entwickelte, das mit YcgE direkt interagiert und so über die kleinen Proteine YcgZ-YmgABC das RcsDBC-abhängige Regulon als Antwort auf Blaulicht, Stress und niedrige Temperaturen kontrolliert. Zusammenfassend hat diese Arbeit zu einem detaillierten Verständnis des Blaulicht-regulierten Netzwerks von E. coli geführt und erstmals die molekulare Wirkungsweise eines degenerierten EAL-Domänen Proteins aufgedeckt. Es konnten neuartige Erkenntnisse über die Funktion, Regulation und Evolution des BLUF-EAL Proteins YcgF, des MerR-ähnlichen Regulators YcgE sowie der kleinen Proteine YcgZ-YmgABC gewonnen werden. Basierend auf den nun bekannten funktionellen Kriterien wird schließlich die Neubenennung von YcgF zu „BluF“ und von YcgE zu „BluR“ vorgeschlagen.
Escherichia coli is a gram-negative enterobacterium, which can exist in the mammalian intestine as well as under outside conditions. Most E. coli K-12 strains have 29 GGDEF/EAL domain-containing proteins, which recently have been recognized to act as diguanylate cyclases and phosphodiesterases, respectively, that “make and break” the ubiquitous bacterial signaling molecule c-di-GMP. In general, c-di-GMP was shown to be a key regulator controlling the switch between the motile planktonic and sedentary biofilm- associated ‘lifestyles’ of bacteria. Interestingly, four of the GGDEF/EAL domain proteins of E. coli are degenerated and according to their amino acid sequences cannot be active as enzymes but have evolved alternative molecular functions. The goal of this study was to characterize the molecular and the physiological function of the complex blue light-signaling pathway from E. coli, which consists of the degenerated EAL-domain-containing blue light- sensor YcgF, the MerR-like regulator YcgE and the YcgF/YcgE-controlled small proteins YcgZ-YmgABC. Whereas YcgF-homologous proteins from some other enterobacteria e. g. Klebsiella pneumoniae contain a conserved EAL domain and act as blue-light regulated phosphodiesterases, this study revealed, that the degenerate YcgF protein from E. coli does not degrade nor even bind the signaling molecule c-di-GMP. Instead, YcgF evolved to act as a direct anti- repressor, which binds to and releases the MerR-like repressor protein YcgE from its operator DNA in a blue-light dependent manner. As a consequence, the expression of the σS-dependent ycgZ-ymgABC operon located next to the ycgE- ycgF region is strongly induced and genome-wide comparative analyses revealed that the ycgE-ycgF-ycgZ-ymgAB region represents a functional unit conserved in various Enterobacteriacea. Our functional analyses of YcgE/YcgF-dependent small proteins demonstrated that YmgA and YmgB activate the RcsDBC- phosphorelay system, which is a major regulator of biofilm maturation processes in bacteria. Thereby YcgZ, YmgA and YmgB form a complex and contact the histidine-kinase domain of the RcsC kinase via the YmgB protein. Independent of the YcgZYmgAB-complex YmgC also interacts with the kinase domain of RcsC. Due to these interactions the small proteins under the YcgE /YcgF-control very likely influence the phosphotransfer between the Rcs-system components, which results in elevated expression of the biofilm matrix substance colanic acid and in down-regulation of adhesive curli fibers. In summary, the small proteins controlled by the anti-repressor YcgF and the MerR-like regulator YcgE act as connectors, which provide additional signal input into the RcsDBC-phosphorelay system. Altogether, this work provides evidence that YcgF evolved from an active PDE to specifically interact with YcgE, to control the RcsDBC-regulon via the small proteins YcgZ-YmgABC in response to blue light, stress and low-temperature. In summary, this study led to a detailed understanding of the blue-light regulated pathway in E. coli including the evolution, regulation and molecular functions of the BLUF-EAL protein YcgF, the MerR-like regulator YcgE and the small proteins YcgZ-YmgABC. Based on the functional criteria we now propose to rename ycgF as “bluF” and ycgE as “bluR” for more meaningful gene designations.
