dc.contributor.author
Tschowri, Natalia
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:29:14Z
dc.date.available
2012-08-20T09:11:36.282Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10549
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14747
dc.description
INHALTSVERZEICHNIS Abbildungsverzeichnis VII Tabellenverzeichnis IX
Abkürzungen XI Zusammenfassung 1 Summary 3 1\. EINLEITUNG 5 1.1 Bakterielle
Lebensstile und das Signalmolekül cyclisches di-GMP 5 1.1.1 Biofilme: eine
weit verbreitete Lebensform von Mikroorganismen 5 1.1.2 Generelle Prinzipien
der c-di-GMP-abhängigen Signalwege 6 1.1.3 C-di-GMP-abhängige
Signaltransduktion in Escherichia coli 9 1.1.4 Degenerierte GGDEF- und EAL-
Domänen Proteine 11 1.2 Lichtrezeptoren als Vermittler der Umweltsignale 13
1.2.1 Diversität der Photorezeptoren 13 1.2.2 Die photosensorischen BLUF-
Domänen-Proteine in Bakterien 16 1.3 Signaltransduktion durch
Zweikomponentensysteme 19 1.3.1 Allgemeine Eigenschaften der bakteriellen
Zweikomponentensysteme 19 1.3.2 Aufbau und Funktion des RcsDBC-
Phosphorelaysystems 21 1.3.3 Connektoren: Kleine Proteine führen zur Vielfalt
der Signalwahrnehmung 25 1.4 Die Regulation der Genexpression durch
Transkriptionsfaktoren 27 1.4.1 Bakterielle Transkriptionsregulatoren 27 1.4.2
Die MerR-Familie der Transkriptionsfaktoren 28 2\. ZIELSETZUNG 33 3\. MATERIAL
UND METHODEN 35 3.1 Chemikalien und Materialien 35 3.2 Medien und
Medienzusätze 36 3.2.1 Flüssigmedien zur Kultivierung von E. coli 36 3.2.2
Feste Medien 37 3.2.3 Medienzusätze 37 3.3 Bakterienstämme, Bakteriophagen und
Plasmide 38 3.4 Mikrobiologische Methoden 42 3.4.1 Wachstumsbedingungen 42
3.4.2 Bestimmung der Zelldichte in Flüssigkulturen 42 3.4.3 Aufbewahrung von
Bakterienstämmen und Bakteriophagenlysaten 42 3.4.4 Sterilisation 42 3.4.5
Herstellung eines P1-Lysats 43 3.4.6 P1-Transduktion 43 3.4.7 Blaulicht-
Experimente 43 3.4.8 Motilitätsassay 44 3.5 Molekularbiologische und
biochemische Methoden 44 3.5.1 Isolation von Plasmid DNA 44 3.5.2 Isolation
von genomischer DNA 44 3.5.3 Polymerasekettenreaktion 44 3.5.4
Punktspezifische Mutagenese mittels Zwei-Schritt PCR 44 3.5.5
Agarosegelelektrophorese 49 3.5.6 Isolation von DNA-Fragmenten aus
Agarosegelen 49 3.5.7 Restriktionsenzymverdau von DNA 49 3.5.8 Ligation von
DNA-Fragmenten 50 3.5.9 TSS-Transformation 50 3.5.10 Herstellung
elektrokompetenter Zellen 50 3.5.11 Elektroporation 50 3.5.12 Sequenzierung
von DNA 51 3.5.13 Konstruktion von Plasmiden mit translationaler lacZ-Fusion
51 3.5.14 Kreuzung translationaler lacZ-Fusion in das Chromosom von
Escherichia coli 51 3.5.15 Inaktivierung chromosomaler Gene mittels PCR-
Produkten 52 3.5.16 β-Galaktosidaseaktivitätstest 52 3.6 RNA-basierte Methoden
und DNA-Microarray-Analyse 53 3.6.1 RNA Handhabung und Aufbewahrung 53 3.6.2
Ernten der Zellen für die RNA-Isolation 53 3.6.3 Zelllyse und RNA-Isolation
54 3.6.4 DNase Verdau und Extraktion der RNA 54 3.6.5 Quantitative Kontrolle
der RNA 55 3.6.6 Qualitative Kontrolle der RNA 55 3.6.7 Synthese Fluoreszenz-
markierter cDNA für die Microarray-Analyse 55 3.6.8 Hybridisierung 56 3.6.9
Scannen und Auswertung des Microarrays 56 3.6.10 Northernblot-Analyse 56
3.6.11 Primer-Extension-Analyse 57 3.7 Protein-basierte Methoden 58 3.7.1 SDS-
Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 58 3.7.2 Immunoblot Analyse
(Western Blot) 59 3.7.3 Überproduktion und Reinigung von Proteinen 59 3.7.4
Protein-DNA-Bindestudien (Elektrophoretische Mobilitäts Shift Assays, EMSA) 61
3.7.5 Nicht-radioaktive DNaseI Footprint Analysen 61 3.7.6 Bacterial-Two-
Hybrid (BTH) Analysen 63 3.7.7 Protein-Protein-Interaktionsstudien mittels Co-
Elution 63 3.7.8 Nachweis der Phosphodiesterase Aktivität 64 3.7.9 UV-
Crosslinking 65 3.8 Datenbanken und bioinformatische Analysen 65 4\.
ERGEBNISSE 67 4.1 Genetische Organisation der ycgE-ycgF-ycgZ-ymgABC-Region im
Chromosom von Escherichia coli 67 4.1.1. Das degenerierte BLUF-EAL Protein
YcgF ist weit verbreitet in Bakterien 67 4.1.2. Das MerR-ähnliche Protein YcgE
- ein Paralog von MlrA? 69 4.1.3. Die ycgE-ycgF-ycgZ-ymgA-ymgB Genregion ist
konserviert in diversen Enterobakterien 71 4.2 Transkriptionsstarts in der
ycgE-ycgF-ycgZ Region des E. coli Genoms 73 4.2.1. Die Identifizierung der
Transkriptionsstarts von ycgE, ycgF und ycgZ 73 4.3 Genexpressionsanalysen von
ycgE und ycgF und der Einfluss von Blaulicht auf das Wachstum von E. coli K-12
74 4.3.1. Die Expression von ycgE und ycgF steigt mit sinkender Temperatur 75
4.3.2. Blaulicht hat einen inhibierenden Einfluss auf das Wachstum von E. coli
bei niedriger Temperatur 76 4.4 Funktionelle Charakterisierung des MerR-
ähnlichen Proteins YcgE 77 4.4.1. YcgE ist ein direkter Repressor des
ycgZymgABC-Operons 78 4.4.2. Identifizierung der YcgE Bindestellen in der ycgZ
Promoter Region mittels Footprint Analysen 79 4.4.3. YcgE ist ein Paralog von
MlrA mit residualer Affinität für den MlrA abhängigen csgD Promoter 82 4.5
Funktionelle Charakterisierung des degenerierten BLUF-EAL Proteins YcgF 83
4.5.1 YcgF kann c-di-GMP weder binden noch abbauen 84 4.5.2 Trotz Einführung
von konservierten Aminosäuren notwendig für die Phosphodiesterase Aktivität,
bleibt YcgF enzymatisch inaktiv und unfähig c-di-GMP zu binden 85 4.5.3
Mikroarrayanalysen zur Identifizierung YcgF abhängiger Gene 87 4.5.4 YcgF
dereprimiert die Expression des ycgZ-ymgABC-Operons 89 4.5.5 YcgF
antagonisiert Blaulicht-abhängig das YcgE Repressorprotein in vitro 91 4.5.6
YcgF antagonisiert das YcgE Repressorprotein durch direkte Protein-Protein-
Interaktion 93 4.5.7 Die Einführung von konservierten Aminosäuren in die EAL-
Domäne von YcgF reduziert dessen Fähigkeit YcgE zu antagonisieren 95 4.5.8
Überexprimiertes YcgF reprimiert die Expression der Curli-Fasern in vivo und
interagiert mit MlrA in vitro 96 4.5.9 Die Einführung von konservierten
Aminosäuren in die EAL-Domäne von YcgF führt zur verbesserten Interaktion
zwischen YcgF und MlrA in vivo 98 4.6 Funktionale Analysen der YcgE/YcgF –
abhängigen kleinen Proteine YcgZ, YmgA, YmgB und YmgC 100 4.6.1 YmgA und YmgB
verstärken die Synthese des Polysaccharids Kolansäure über das RcsDBC-
Phosphorelaysystem 101 4.6.2 YmgB inhibiert die Expression der Curli-Fasern
über die RcsB-abhängige kleine RNA RprA 102 4.6.3 YmgB aktiviert die
Expression des RcsDBC-abhängigen Gens bdm 103 4.6.4 YcgZ, YmgA und YmgB bilden
einen Komplex ohne YmgC 105 4.6.5 YmgB und YmgC interagieren mit der Histidin-
Kinase Domäne von RcsC 106 5\. DISKUSSION 111 5.1 Die Evolution und Funktion
von YcgE – ein MerR-ähnliches MlrA-Paralog mit speziellen Eigenschaften 111
5.2 Die Evolution und Funktion von YcgF – eine Phosphodiesterase wird zum
anti-Repressor 114 5.3 YcgZ, YmgA, YmgB und YmgC: kleine Proteine als
Verbindung zwischen dem YcgF/YcgE-Netzwerk und dem RcsDBC-Phosphorelaysystem
119 5.4 YcgE-YcgF-YcgZ-YmgA-YmgB ist eine konservierte Einheit in
Enterobakterien 124 5.5 Ein Gesamtbild: Das YcgF/YcgE/Ymg-abhängige Netzwerk
integriert Licht-, Temperatur- sowie Stresssignale und moduliert die
Biofilmbildung von E. coli 125 6\. LITERATURVERZEICHNIS 131
dc.description.abstract
Escherichia coli ist ein gram-negatives Enterobakterium, das sowohl innerhalb
eines Wirtes als auch im Freien existieren kann. Die meisten E. coli K-12
Stämme kodieren für 29 GGDEF/EAL-Domänen Proteine, die im Allgemeinen
Diguanylatzyklase- bzw. Phosphodiesterase-Aktivitäten besitzen und das in
Bakterien ubiquitär vorkommende Signalmolekül c-di-GMP synthetisieren bzw.
abbauen. Generell steuert c-di-GMP den Übergang von einer planktonischen zu
einer adhäsiven Lebensweise von Bakterien. Vier der GGDEF/EAL-Domänen Proteine
von E. coli sind jedoch stark degeneriert und haben statt der enzymatischen
Aktivität alternative Funktionen im Laufe der Evolution erworben. Das YcgF-
Protein von E. coli repräsentiert ein degeneriertes EAL-Domänen Protein, das
mittels der N-terminalen BLUF-Domäne Blaulichtsignale wahrnimmt. YcgF, der
MerR-ähnliche Regulator YcgE und die kleinen Proteine YcgZ-YmgABC bilden ein
komplexes Blaulicht-kontrolliertes Netzwerk in E. coli. Das Ziel dieser
Dissertationsstudie war es, die molekulare und die physiologische Funktion
dieses Blaulichtsignaltransduktionssystems im Kontext der Biofilmbildung unter
Berücksichtigung evolutionärer Aspekte aufzuklären. Während YcgF in anderen
Bakterien eine konservierte EAL-Domäne aufweist und z. B. in Klebsiella
pneumoniae als eine Blaulicht-regulierte Phosphodiesterase aktiv ist, zeigen
die Ergebnisse dieser Arbeit, dass YcgF von E. coli seine Fähigkeit das
Signalmolekül c-di-GMP abzubauen oder zu binden aufgegeben hat und nun als
direkter anti-Repressor agiert. Dabei interagiert es mit dem MerR-ähnlichen
Protein YcgE und verhindert in Abhängigkeit von Blaulicht die Bindung dieses
Repressors an seine Operator-DNA. Dies führt zu erhöhter Expression des an die
ycgE-ycgF Region angrenzenden σS-abhängigen ycgZ-ymgABC-Operons, wobei die
ycgE-ycgF-ycgZ-ymgA-ymgB-Region eine in diversen Enterobakterien konservierte
funktionale Einheit darstellt. In dieser Arbeit erzielte Ergebnisse zur
Funktion der YcgE/YcgF-abhängigen kleinen Proteine verdeutlichen, dass YmgA
und YmgB das komplexe RcsDBC-Phosphotransfer System, das wichtige Prozesse der
Biofilmreifung in Enterobakterien reguliert, aktivieren und dadurch u. a. zu
erhöhter Expression der Biofilmmatrix Kolansäure und zu geringeren Synthese
der adhäsiven Curli-Fasern führen. Dabei bilden YcgZ, YmgA, YmgB einen
Komplex, der vermittelt durch YmgB mit der Histidin-Kinase-Domäne von RcsC
interagiert und möglicherweise den Phosphotransfer zwischen den Komponenten
des Rcs-Systems beeinflusst. Separat von diesem Komplex interagiert auch YmgC
mit der Kinase-Domäne von RcsC. Somit agieren die kleinen Proteine unter der
Kontrolle des anti-Repressors YcgF und des MerR-ähnlichen Regulators YcgE als
Connektoren, die das YcgF/YcgE-Netzwerk mit dem RcsDBC-System verbinden und
auf diese Weise das durch das Rcs-System wahrnehmbare Signalspektrum
erweitern. Insgesamt wird aus dieser Studie deutlich, dass YcgF sich im Laufe
der Evolution aus einer aktiven Blaulicht-regulierten Phosphodiesterase zu
einem anti-Repressor Protein entwickelte, das mit YcgE direkt interagiert und
so über die kleinen Proteine YcgZ-YmgABC das RcsDBC-abhängige Regulon als
Antwort auf Blaulicht, Stress und niedrige Temperaturen kontrolliert.
Zusammenfassend hat diese Arbeit zu einem detaillierten Verständnis des
Blaulicht-regulierten Netzwerks von E. coli geführt und erstmals die
molekulare Wirkungsweise eines degenerierten EAL-Domänen Proteins aufgedeckt.
Es konnten neuartige Erkenntnisse über die Funktion, Regulation und Evolution
des BLUF-EAL Proteins YcgF, des MerR-ähnlichen Regulators YcgE sowie der
kleinen Proteine YcgZ-YmgABC gewonnen werden. Basierend auf den nun bekannten
funktionellen Kriterien wird schließlich die Neubenennung von YcgF zu „BluF“
und von YcgE zu „BluR“ vorgeschlagen.
de
dc.description.abstract
Escherichia coli is a gram-negative enterobacterium, which can exist in the
mammalian intestine as well as under outside conditions. Most E. coli K-12
strains have 29 GGDEF/EAL domain-containing proteins, which recently have been
recognized to act as diguanylate cyclases and phosphodiesterases,
respectively, that “make and break” the ubiquitous bacterial signaling
molecule c-di-GMP. In general, c-di-GMP was shown to be a key regulator
controlling the switch between the motile planktonic and sedentary biofilm-
associated ‘lifestyles’ of bacteria. Interestingly, four of the GGDEF/EAL
domain proteins of E. coli are degenerated and according to their amino acid
sequences cannot be active as enzymes but have evolved alternative molecular
functions. The goal of this study was to characterize the molecular and the
physiological function of the complex blue light-signaling pathway from E.
coli, which consists of the degenerated EAL-domain-containing blue light-
sensor YcgF, the MerR-like regulator YcgE and the YcgF/YcgE-controlled small
proteins YcgZ-YmgABC. Whereas YcgF-homologous proteins from some other
enterobacteria e. g. Klebsiella pneumoniae contain a conserved EAL domain and
act as blue-light regulated phosphodiesterases, this study revealed, that the
degenerate YcgF protein from E. coli does not degrade nor even bind the
signaling molecule c-di-GMP. Instead, YcgF evolved to act as a direct anti-
repressor, which binds to and releases the MerR-like repressor protein YcgE
from its operator DNA in a blue-light dependent manner. As a consequence, the
expression of the σS-dependent ycgZ-ymgABC operon located next to the ycgE-
ycgF region is strongly induced and genome-wide comparative analyses revealed
that the ycgE-ycgF-ycgZ-ymgAB region represents a functional unit conserved in
various Enterobacteriacea. Our functional analyses of YcgE/YcgF-dependent
small proteins demonstrated that YmgA and YmgB activate the RcsDBC-
phosphorelay system, which is a major regulator of biofilm maturation
processes in bacteria. Thereby YcgZ, YmgA and YmgB form a complex and contact
the histidine-kinase domain of the RcsC kinase via the YmgB protein.
Independent of the YcgZYmgAB-complex YmgC also interacts with the kinase
domain of RcsC. Due to these interactions the small proteins under the YcgE
/YcgF-control very likely influence the phosphotransfer between the Rcs-system
components, which results in elevated expression of the biofilm matrix
substance colanic acid and in down-regulation of adhesive curli fibers. In
summary, the small proteins controlled by the anti-repressor YcgF and the
MerR-like regulator YcgE act as connectors, which provide additional signal
input into the RcsDBC-phosphorelay system. Altogether, this work provides
evidence that YcgF evolved from an active PDE to specifically interact with
YcgE, to control the RcsDBC-regulon via the small proteins YcgZ-YmgABC in
response to blue light, stress and low-temperature. In summary, this study led
to a detailed understanding of the blue-light regulated pathway in E. coli
including the evolution, regulation and molecular functions of the BLUF-EAL
protein YcgF, the MerR-like regulator YcgE and the small proteins YcgZ-YmgABC.
Based on the functional criteria we now propose to rename ycgF as “bluF” and
ycgE as “bluR” for more meaningful gene designations.
en
dc.format.extent
XII, 145 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Ein Blaulicht-kontrolliertes regulatorisches Netzwerk der Biofilmbildung in
Escherichia coli
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Regine Hengge
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Kürşad Turgay
dc.date.accepted
2012-08-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000038799-5
dc.title.translated
Blue light signaling in the control of biofilm formation in Escherichia coli
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000038799
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