Ror2 ist eine Rezeptortyrosinkinase, die zur Familie der Ror-Proteine gehört und im Tierreich konserviert ist. Im Menschen führen Mutationen in ROR2 zu zwei kongenitalen, das Skelett betreffende, Erkrankungen. Mutationen, die vermutlich zu einem Funktionsverlust von ROR2 führen, verursachen das autosomal rezessive Robinow Syndrom, während die Brachydaktylie Typ B (BDB) von dominanten Mutationen in ROR2 verursacht wird, die vermutlich zu einem Funktionsgewinn des Proteins oder aber zu einem dominanten Effekt des mutierten Proteins über einen möglichen Dimerisierungspartner führen. Mäuse, in denen beide Kopien des Ror2-Gens inaktiviert wurden, sterben kurz nach der Geburt. Im Vergleich zu ihren Wildtyp-Geschwistern zeigen sie einen schweren Knorpel/Knochen-Phänotyp, sind kleiner und haben verkürzte Extremitäten. Analysen der humanen Erkrankungen und die Untersuchung dieser Mäuse haben zu der Hypothese geführt, daß Ror2 während der Embryogenese eine wichtige Funktion in der Differenzierung von Knorpelzellen spielt.
Obwohl Ror2 bereits im Jahre 1992 beschrieben wurde, ist bis heute nur wenig über Signalwege, an denen Ror2 partizipiert, oder über Interaktionspartner bekannt. Daher war die Identifikation neuer intrazellulärer Bindungspartner von Ror2 das Ziel dieser Arbeit. Dazu wurde mit dem cytoplasmatischen Bereich von Ror2 in Yeast Two Hybrid \- und Yeast Three Hybrid -Analysen eine Maus- embryonale cDNA Bibliothek (E9,5-10.5) nach Ror2 Interaktionspartnern durchsucht. Dadurch konnten insgesamt 23 potentielle Interaktionspartner von Ror2 identifiziert werden. Im Rahmen dieser Studie wurden zwei dieser potentiellen Interaktionspartner weiter bearbeitet.
Dlxin-1 ist ein Protein, das ursprünglich als Dlx5 Bindungspartner identifiziert wurde. Im Yeast Three Hybrid -Experiment ist es der am häufigsten gefundene Interaktionspartner von Ror2. Durch Retransformations- Experimente ließ sich der Ort der Interaktion am distalen Bereich von Ror2 ausmachen. Aufgrund dieser Ergebnisse und Veröffentlichungen anderer Arbeitsgruppen, läßt sich spekulieren, daß Ror2 über die Bindung von Dlxin-1 die Lokalisation und das Zusammenspiel verschiedener Transkriptionsfaktoren (Dlx5, Msx2) beeinflussen könnte, wodurch eine Feinregulation in der Knorpeldifferenzierung erreicht werden könnte.
Ein weiterer potentieller Interaktionspartner von Ror2 wurde unabhängig, sowohl im Yeast Two Hybrid \- als auch im Yeast Three Hybrid -Experiment, identifiziert. Dabei handelt es sich um Wtip, ein erst kürzlich beschriebenes LIM Domänen-Protein. Wtip besitzt drei C-terminal gelegene LIM Domänen, von denen die ersten beiden Domänen für die Interaktion mit Ror2 verantwortlich sind. Die Bindung an Ror2 wurde durch Retransformations- und Co- Immunopräzipitationsexperimente bestätigt, sie findet am distalen Bereich von Ror2 statt. Mit Hilfe von in situ Hybridisierungen an Maus Gefrierschnitten und Ganztierpräparaten konnte die Co-Expression von Wtip und Ror2 in verschiedenen Geweben (z.B. in Extremitätenknospen, Niere, Lunge, Herz, Zahnanlagen) gezeigt werden. Zusätzlich konnten beide Proteine durch immunhistologische Untersuchungen auf Maus Gefrierschnitten in Niere, Darm, Lunge und Rippen innerhalb der selben Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Wtip und Ror2 auch in vivo miteinander interagieren könnten. Über eine Funktion dieser Interaktion läßt sich nur schwer spekulieren, da über Wtip bisher nur wenig bekannt ist. Jedoch konnte für Wtip, sowie für andere Proteine derselben Unterfamilie, gezeigt werden, daß diese Proteine, obwohl sie primär cytoplasmatisch lokalisieren, von der Zellmembran in den Kern der Zelle gelangen und dort die Aktivität von transkriptionellen Regulatoren modulieren können. Ob Ror2 an einer solchen Funktion beteiligt sein könnte, bedarf jedoch noch genauerer Untersuchungen.
Ror2 is a membrane-bound receptor tyrosine kinase, which belongs to the family of Ror proteins. Ror2 has been implicated in chondrogenesis as shown by the severe chondrodysplasia phenotype in Ror2 knock out mice. Mutations in ROR2 have been described to be responsible for autosomal dominant brachydactyly type B and the autosomal recessive Robinow syndrome. However, protein interactions and signalling pathways in which Ror2 participates remain poorly understood to date.
In this study the cytoplasmatic part of Ror2 was used to perform yeast two hybrid- and yeast three hybrid assays. Screening was performed against a cDNA library obtained from mouse embryos stage E9.5 to E10.5. In both screens 23 potential Ror2 interaction partners have been identified, two of them have been further investigated. In this study Dlxin-1 is the most frequently identified interaction partner of Ror2. The interaction between Ror2 and Dlxin-1 was mapped to the distal part of Ror2. Dlxin-1 itself has recently been identified as a Dlx5 interaction partner. Since Dlx5 is known to act as a positive regulator of chondrocyte differentiation it is tempting to speculate that binding of Dlxin-1 to Ror2 can modulate subcellular localisation and transcriptional properties of Dlx and Msx proteins to fine-tune chondrocyte differentiation and maturation.
In addition, Wtip was identified as a novel potential interaction partner of Ror2. Wtip is a LIM domain containing protein with three C-terminal LIM domains. The fragment isolated in the screen showed that interaction with Ror2 is mediated through the first two LIM domains, whereas the third domain seems to be dispensable. Binding to Ror2 occurs at the distal part of Ror2 as demonstrated by retransformation studies in yeast und co-immunoprecipitation in HEK293 cells. In whole mount and section in situ hybridisations co- expression of Wtip and Ror2 could be shown in several tissues and organs (e.g. limb buds, kidneys, lung, heart, tooth anlagen). But more importantly co- expression of both proteins could also be demonstrated in the same cells in kidney, lung, intestine and rib condensations by antibody stainings. These results support the idea that interaction between Ror2 and Wtip could also be of relevance in vivo. Since Wtip has been identified only recently, it is hard to speculate about the function of an interaction between Ror2 and Wtip. However, Wtip as other members of the same subfamily of proteins, have been shown to shuttle between cytoplasm and nucleus to modulate the function of transcriptional regulators. Further experiments will have to clarify if Ror2 plays a role in this process and if Wtip is able to mediate Ror2 functions in the nucleus.