dc.contributor.author
Hucho, Tim
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:27:18Z
dc.date.available
2002-07-10T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10502
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14700
dc.description
0 Titelblatt 1
1 Zusammenfassung 9
2 Abstract 10
3 Einleitung 11
3.1 Biologische Funktion der Neurotrophine 11
3.2 Struktur der Neurotrophine 13
3.3 Die Rezeptoren der Neurotrophine 14
3.3.1 Die Trk Rezeptoren 15
3.3.2 Der Neurotrophinrezeptor p75NTR 16
4 Zielsetzung der Arbeit 21
4.1 Reinigung von intrazellulären Interaktoren 21
4.1.1 Experimentelle Ansätze zur Identifikation von intrazellulären
Interaktoren 21
4.2 Suche nach p75NTR-ähnlichen Molekülen 23
5 Material und Methoden 25
5.1 Material 25
5.1.1 Antikörper 25
5.1.2 Tiere 26
5.1.3 Zelllinien 26
5.1.4 Modifizierte Lambda Phosphatase 26
5.1.5 Neurotrophine 27
5.1.6 Plasmide 27
5.1.7 Medien 27
5.1.8 Adjuvantien 27
5.1.9 Chemikalien und Zubehör 28
5.1.10 Geräte 29
5.1.11 Puffer 30
5.2 Methoden 34
5.2.1 Aufreinigung intrazellulärer Interaktoren von p75NTR 34
5.2.1.1 P75NTR Konzentrationsbestimmung in Gehirnhomogenat 34
5.2.1.2 Expression und Aufreinigung des p75NTR-IZD Plasmids 34
5.2.1.3 Verwendung der BIAcore Maschine 35
5.2.1.4 Iodierung von Neurotrophinen 36
5.2.1.5 Dissoziation von Spinalganglien 37
5.2.1.6 Overlayblots 38
5.2.1.7 In vitro Translation der intrazellulären Domäne von p75NTR 38
5.2.1.8 Kopplung von 125I-Neurotrophin an p75NTR für Overlayblots 39
5.2.1.9 Bindungsstudien an dissoziierten Spinalganglien Neuronen 39
5.2.1.10 Präparation von Caveolae mit Triton X-100 40
5.2.1.11 Präparation von Caveolae mit NaCO3 40
5.2.1.12 Präparation von ?Postsynatic Densities? (PSDs) 41
5.2.2 Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von p75NTR-ähnlichen
Proteinen 42
5.2.2.1 Herstellung polyklonaler Seren gegen die intrazelluläre Domäne von
p75NTR 42
5.2.2.2 Organpräparation 42
5.2.2.3 Dephosphorylierung der FreundI Antigene 42
5.2.2.4 Bindungsassay an Spinalganglien 43
5.2.2.5 Reinigung des FreundI Antigens 43
5.2.2.6 Sequenzvergleich und Phosphorylierungsvorhersagen 44
5.2.2.7 Peptidkompetition im Westernblot 44
5.2.2.8 Präparation von Körnerzellen 45
5.2.2.9 Immunhistochemie 45
5.2.3 Vermischtes 46
5.2.3.1 NGF-ELISA 46
5.2.3.2 Herstellung einer stabilen Zelllinie 46
5.2.3.3 Biologischer Überlebensassay 47
5.2.3.4 Anzucht und Lagerung von E. coli-Bakterien 48
5.2.3.5 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) 48
5.2.3.6 Semi-dry Westernblot 49
5.2.3.7 Entfernung von Antikörpern von Blotmembranen (?Strippen des Blots?) 49
5.2.3.8 Coomassie Färbung von Gelen 49
5.2.3.9 Silberfärbung von SDS-PAGE Gelen 50
5.2.3.10 Kolloidal Coomassie Färbung von SDS-PAGE Gelen 50
5.2.3.11 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 50
6 Ergebnisse 51
6.1 Biochemischen Aufreinigung intrazellulärer Interaktoren von p75NTR 51
6.1.1 Affinitätsreinigung in Gegenwart des extrazellulären Liganden 51
6.1.2 Affinitätsreinigung über die intrazelluläre Domäne von p75NTR 52
6.1.2.1 Protein Interaktionsmessungen mit der BIAcoremaschine 52
6.1.2.2 Interaktorendetektion mit Overlayblots 55
6.1.3 Anreicherung von Interaktoren in funktionell charakterisierten,
subzellulären
Fraktionen 57
6.1.3.1 Präparation von Caveolae 57
6.1.3.2 Präparation von Postsynaptischen Dichten (PSDs) 58
6.2 Charakterisierung, Reinigung und Identifizierung von p75NTR-ähnlichen
Proteinen 60
6.2.1 P75NTR Antiserum zeigt Westernblotsignal auch in p75NTR -/- Mäusen 60
6.2.2 FreundI Antigene sind nur im ZNS exprimiert 62
6.2.3 FreundI Antigene werden postnatal herunterreguliert 63
6.2.4 FreundI Antigen Westernblotsignal ist kalziumabhängig 63
6.2.5 FreundI Antigene wechseln die Zentrifugationsfraktion nach Inkubation 64
6.2.6 p75NTR Seren detektieren FreundI Antigene in dephosphoryliertem Gehirn-
homogenat 65
6.2.7 P75NTR-ähnliche Immunfärbung in p75NTR -/- Basal Ganglien 67
6.2.8 P75NTR-ähnliche Bindung an dissoziierten Spinalganglien von p75NTR-/-
Tieren 67
6.2.9 Reinigung der FreundI Antigene 68
6.2.10 Identifikation der FreundI Antigene als N-Terminus von MAP1B 73
6.2.11 Die FreundI Antigene werden von einem MAP1B Antiserum detektiert 74
7 Diskussion
8 Abkürzungen und Begriffe
10 Danksagung
11 Literaturverzeichnis
dc.description.abstract
Neurotrophine sind Wachstumsfaktoren. In Säugern modulieren sie nicht nur
weitreichende Aspekte der Entwicklung sondern auch Funktionen des erwachsenen
Nervensystems. Die Signaltransduktion erfolgt einerseits über den Rezeptor
p75NTR andererseits über die Rezeptor-Tyrosinkinasen TrkA, TrkB und TrkC.
Während die Signalkaskaden der Trk Rezeptoren weitgehend aufgeklärt wurden,
entwickelte sich das Wissen über p75NTR ebenso wie das über die verwandten
Mitglieder der ?Tumor Necrosis Factor Rezeptor? (TNFR)-Superfamilie nur
langsam. 10 Jahre nach der Klonierung sollten mit dieser Arbeit daher die
intrazellulären Interaktoren von p75NTR identifiziert werden. Ebenso wie zur
Aufklärung der Signalwege anderer Mitglieder der TNFR-Superfamilie wurden
biochemische Reinigungsansätze unternommen. Sowohl die Reinigung des p75NTR-
Interaktorkomplexes in Gegenwart extrazellulärer Liganden, als auch die
Affinitätsreinigung über die intrazelluläre Domäne sowie die Anreicherung des
p75NTR-Interaktorkomplexes in charakterisierten subzellulären Fraktionen wurde
vorgenommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zudem neue Antiseren gegen p75NTR
hergestellt. Eines dieser Seren zeigte zusätzliche p75NTR-ähnliche
Westernblotsignale. Überraschenderweise konnten diese Signale auch in
Gehirnhomogenaten des 1992 hergestellten p75NTR-Teil-Knockout sowie in dem bis
dahin nur in unserem Labor zugänglichen ersten vollständigen p75NTR-Knockout
detektiert werden. Die Expression der p75NTR-ähnlichen Proteine war auf das
Gehirn beschränkt, wurde postnatal stark herunterreguliert und zeigte in
differenzieller Zentrifugation starke Kalziumabhängigkeit. Zusätzlich konnte
in p75NTR-Knockout-Tieren eine p75NTRähnliche Bindungsstelle identifiziert
werden. Die p75NTR-ähnlichen Proteine wurden gereinigt, als N-Terminus von des
Mikrotubuli Assoziierten Proteins 1B (MAP1B) identifiziert und die Homologie
zu p75NTR untersucht.
de
dc.description.abstract
Neurotrophins are growth factors. In mammals, they exert a broad range of
modulatory effects on developing as well as on mature neurons.
Neurotrophinmediated signals are transduced by either the neurotrophin
receptor p75NRT or the receptor tyrosine kinases TrkA, TrkB and TrkC. Whereas
signaling via the Trkreceptors is quite well understood, even 10 years after
its identification there was little known about the function and signaling
pathways of p75NTR. The aim of this work was therefore to identify
intracellular interactors of p75NTR. A biochemical approach was chosen, as was
previously applied to related proteins of the TNFR-family. Three different
purification strategies were used: 1) purification of the p75NTR-interactor
complex in the presence of its extracellular ligands, 2) affinity purification
via the intracellular domain of p75NTR and 3) enrichment of the p75NTR-
interactor complex in characterized subcellular fractions. In addition, new
antisera against p75NTR were generated and characterized. One antiserum
recognized additional p75NTR-like signals on Western blot. Surprisingly, these
signals remained strongly detectable in brain homogenates of a partial as well
as a complete p75NTR-/- knock out mouse. The p75NTR-like antigens were
expressed exclusively in the central nervous system, were strongly
downregulated during postnatal development and showed calcium-dependent
segregation during centrifugation. In addition, a p75NTR-like binding site was
detected in dissociated dorsal root ganglia of the complete p75NTR knock out
mouse. The p75NTR?like antigens were purified, identified as the N-terminus of
the microtubule associated protein MAP1B and the homology to p75NTR was
investigated.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Der Neurotrophinrezeptor p75NTR
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Yves-Alain Barde
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ralf Erdmann
dc.date.accepted
2002-05-30
dc.date.embargoEnd
2002-08-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002001150
dc.title.subtitle
Eine biochemische Untersuchung
dc.title.translated
The neurotrophin receptor p75NTR
en
dc.title.translatedsubtitle
A biochemical approach
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000845
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/115/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000845
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open access