SORLA (sorting protein-related receptor with A-type repeats) is a type-I transmembrane receptor and a member of VPS10P (vacuolar protein sorting 10 protein)-domain receptor family. The receptor is expressed in neurons of the cortex, hippocampus and cerebellum of the brain. SORLA is strongly implicated in Alzheimer disease (AD) as shown in transgenic mouse models and cell culture experiments. Studies in cell culture uncovered a mechanism how SORLA is protective in AD; SORLA acts as a retention factor for amyloid precursor protein (APP) and prevents its localization to the compartments where its proteolytic processing occurs. A role for SORLA in AD is supported by a substantial amount of data from human studies. Thus, expression profiling studies showed that levels of SORLA are selectively reduced in disease- vulnerable regions of the brain in the patients with sporadic AD compared to the control individuals. Genetic association studies confirmed the casual role for SORLA in AD, as multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) in SORL1 (the gene encoding SORLA) are associated with the disease. Although some SNPs in SORL1 were previously correlated with certain AD biomarkers, the molecular mechanism how they confer the risk for the disease was not known. I hypothesized that these genetic variants may control expression levels of SORLA. To test my hypothesis, I collected a sample set consisting of 88 brain autopsy specimens. Next, I genotyped the selected risk SNPs and determined SORLA concentrations in the sample set using a specific and reliable ELISA developed by me. In line with reduced expression of SORLA as a disease causing factor, association analyses of the genetic data and protein levels revealed that two SNPs in SORL1, rs2070045 and rs1699102, are associated with reduced SORLA expression levels in the brain. Interestingly, measurements of the RNA levels in the brain samples didn’t show any effects of the SNPs on transcript levels. Rather, analyses of protein and RNA expression levels in the cells showed that these risk variants are affecting SORLA expression post- transcriptionally. Ineffective codon usage due to the silent mutations might be the reason causing lower expression of SORLA in the patients carrying the risk variants. Consistent with reduced expression of SORLA in the patients with AD, deficiency of the receptor in the mouse brain results in increased amyloidogenic processing and accumulation of amyloid (A)-beta, hallmarks of AD. Conceptually, increasing SORLA expression may thus represent a therapeutic approach in AD. To test this hypothesis, I carried out a second project whereby I generated a transgenic mouse line overexpressing SORLA (Rosa26Tg/+) by inserting human SORLA cDNA into the murine Rosa26 locus. I showed using ELISA that SORLA concentration is increased 4-5-fold in the brain of Rosa26Tg/+ mice compared to control (Rosa26+/+) animals expressing only the murine receptor. Further characterization of Rosa26Tg/+ mice by immunostainings revealed neuronal localization of SORLA expressed by the transgene. These results demonstrated that Rosa26Tg/+ mice represent a valid and efficient model to study effects of overexpression of SORLA in vivo. Next, I analyzed processing products of murine APP in the brain. I also evaluated human APP processing by breeding the mouse line with a rodent model of AD expressing the human APP transgene. In line with protective role of SORLA, neuronal overexpression of the receptor in the brain resulted in 2-3-fold decrease in A-beta accumulation both for the murine and human models. Surprisingly, other processing products of APP remained unaltered in Rosa26Tg/+ mice. To exclude that the known catabolic pathways of A-beta weren’t changed in Rosa26Tg/+ mice, I showed major A-beta degrading enzymes and clearance receptors were similar in Rosa26Tg/+ and Rosa26+/+ mice. As a consequence, I reasoned a novel and previously unrecognized function for SORLA in clearance of A-beta. In support of this model, I showed that non-neuronal cells as well as primary neuronal cells overexpressing SORLA internalized more A-beta as compared to control cells. Additionally, I showed that the internalized A-beta is transported to lysosomes for degradation. Hence, my studies suggest a novel function of SORLA supporting the protective role of the receptor in AD; addition to inhibiting processing of APP, SORLA might be involved in cellular catabolism of A-beta. Taken together, my studies have identified a unique genetic mechanism whereby two SNPs control levels of SORLA expression in the human brain. Moreover, I have uncovered a novel role for SORLA in clearance of A-beta that may underlie the protective effect on AD seen in individuals with high receptor activity in the brain.
SORLA („sorting protein-related receptor with A-type repeats“) ist ein Typ-I- Transmembranrezeptor, welcher zur Familie der Rezeptoren mit VPS10P („vacuolar protein-sorting 10 protein“)-Domäne gehört. Im Gehirn ist der Rezeptor in Neuronen des Cortex, Hippocampus und des Cerebellums exprimiert. SORLA steht im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit, wie transgene Mausmodelle und Zellkulturexperimente gezeigt haben. Studien mittels Zellkulturen fanden einen zellulären Mechanismus, in dem sich SORLA protektiv auf die Alzheimer- Krankheit auswirkt; dabei fungiert SORLA als Retentionsfaktor, der APP („amyloid precursor protein“) im trans-Golgi Netzwerk der Zelle zurück hält und somit verhindert, dass das Protein in entferntere Zellkompartimente gelangt, in denen es proteolytisch prozessiert werden kann. Die Rolle von SORLA in der Alzheimer-Krankheit wird durch eine profunde Anzahl an Patientendaten belegt. Expressionsprofile dieser Patienten haben gezeigt, dass die Menge an SORLA bei Patienten mit sporadischer Alzheimer-Krankheit in Regionen des Gehirns reduziert ist, in denen sich Symptome der Alzheimer- Krankheit als erstes manifestieren. Studien, die eine genetische Assoziation von SORLA und der Alzheimer-Krankheit untersucht haben, ergaben, dass mehrere Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs, „single nucleotide polymorphisms“) in SORL1, dem SORLA kodierendem Gen, mit der Erkrankung assoziiert sind. Obwohl bereits gezeigt werden konnte, dass einige dieser SNPs in SORL1 mit bestimmten Biomarkern für die Alzheimer-Krankheit korrelieren, war der molekulare Mechanismus, wie diese SNPs zu einem höheren Risiko der Erkrankung beitragen, nicht bekannt. Anhand meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass diese genetischen Varianten die Expressionsmenge von SORLA beeinflussen können. Dabei wurden 88 Patientenproben aus Gehirnautopsien gesammelt und auf auserwählte Risiko-SNPs genotypisiert, sowie die Menge an SORLA in diesen Gehirnproben bestimmt. Dazu hatte ich im Vorfeld einen spezifischen und verlässlichen ELISA für SORLA entwickelt. Die Assoziationsanalyse der genetischen SNP-Daten und der Proteinmengen ergaben, dass zwei SNPs in SORL1, rs2070045 und rs1699102, mit reduzierten Expressionsmengen von SORLA im Gehirn assoziiert sind. Interessanterweise hatten diese SNPs jedoch keinerlei Effekt auf die Transkriptionsaktivität des SORLA-Gens in den Gehirnautopsien. Vielmehr stellte sich heraus, dass bei genauer Untersuchung der Protein- und RNA-Mengenim Zellkultursystem die SNPs die Expression von SORLA posttranskriptionell beeinflussen. Denkbar ist, dass die durch stille Mutationen veränderten Aminosäure-Codons nur ineffektiv translatiert werden können und somit ursächlich für die verminderte Expression von SORLA in Alzheimer-Patienten mit diesen Risikovarianten sind. Analog zu Alzheimer- Patienten mit verminderter SORLA-Expression, führt eine SORLA-Defizienz im Mausgehirn zu einer erhöhten amyloiden Prozessierung und somit zu einer Akkumulation von amyloid (A)-beta-Peptiden, einem Kennzeichen der Alzheimer- Krankheit. Konzeptionell sollte eine erhöhte Expression von SORLA somit eine therapeutische Wirkung auf die Alzheimer-Krankheit haben. Um diese Hypothese zu untersuchen, generierte ich im zweiten Teil meiner Doktorarbeit eine transgene Mauslinie, welche SORLA (Rosa26Tg/+) überexprimiert., Anhand dieser Tiere konnte gezeigt werden, dass die Konzentration von SORLA in Gehirnen von Rosa26Tg/+-Tieren vier- bis fünffach erhöht war im Vergleich zu Kontrolltieren (Rosa26+/+), welche nur den murinen Rezeptor exprimieren. Zur weiteren Charakterisierung der Rosa26Tg/+-Tiere konnte ich in Immunfärbungen zeigen, dass das SORLA-Transgen in Neuronen exprimiert wird und sich somit die Rosa26Tg/+-Mäuse als valides und effizientes Tiermodell eignet, um die Effekte einer Überexpression von SORLA in vivo genauer zu untersuchen. Als nächstes habe ich sowohl die Prozessierungsprodukte von murinem und humanem APP im Gehirn analysiert,indem ich meine transgene Mauslinie in ein Mausmodel der Alzheimer-Krankheit eingekreuzt habe. Übereinstimmend mit der protektiven Rolle von SORLA, war die murine und humane A-beta-Akkumulation in den Gehirnen um zwei- bis dreifach verringert, während . die anderen Prozessierungsprodukte von APP in den Rosa26Tg/+-Tieren unverändert blieben. Um auszuschließen, dass die bekannten katabolen Abbauwege von A-beta-Peptide in den Rosa26Tg/+-Tieren verändert waren, untersuchte ich verschiedene Enzyme und Rezeptoren, die hauptsächlich für den Abbau von A-beta-Peptide verantwortlich sind, und konnte keinerlei Unterschiede zwischen Rosa26Tg/+ und Rosa26+/+-Tieren feststellen. Diese Resultate ließen mich zu der Schlussfolgerung kommen, dass SORLA eine neue und bisher unbekannte Funktion in der Beseitigung von A-beta-Peptide haben muss. Daten, die dieses Modell stützen, zeigten, dass sowohl nicht- neuronale Zellen als auch primäre Neuronen bei einer Überexpression von SORLA mehr A-beta-Peptide internalisieren als Kontrollzellen. Weiterhin wurde deutlich, dass internalisiertes A-beta in Lysosomen zur Degradation transportiert wird. Basierend auf meinen Resultaten schlage ich eine neuartige Funktion für SORLA vor, die eine protektive Rolle des Rezeptors bezüglich der Alzheimer-Krankheit einnimmt; zusätzlich zur Inhibierung der APP-Prozessierung könnte SORLA am zellulären Katabolismus von A-beta-Peptiden beteiligt sein. Zusammenfassend haben meine Untersuchungen einen einzigartigen genetischen Mechanismus identifiziert, in welchem zwei SNPs die Expression von SORLA im menschlichen Gehirn kontrollieren. Des Weiteren habe ich eine neuartige Rolle für SORLA in der Beseitigung von A-beta-Peptiden gefunden, welche der Grund für den protektiven Effekt auf die Alzheimer-Krankheit in Individuen mit hoher Rezeptoraktivität im Gehirn darstellen könnte.
