Aberrant regulation of given key factors involved in gonad development is the cause of a variety of syndromes associated with disorders of sexual development (DSDs). WT1 and GATA4 are two transcription factors that are implicated and essential for the proper development of the gonad. The functional relevance of WT1 and GATA4 during sex determination is well described. But knowledge in terms of their contribution to the female and male gonad during the sex differentiation phase remains somewhat elusive. This states the central focus of this thesis. In order to address this issue, gonads of wild type Wt1+/+ and Wt1-/- deficient mice were compared in terms of morphology and gene expression status. Further, I established an ex-vivo organ culture system that combines the hanging droplet culture technique and an antisense oligonucleotide strategy using vivo-morpholinos against Wt1 and Gata4. This system allows the analysis of the morphology and the gene expression status in single gonadal organ cultures. The data show that WT1 is required to establish a sex specific signature in both sexes. The knockdown of WT1 in ex-vivo cultures results in the down regulation of testis specific genes, e.g., Amh, Amhr2, Sf1 and Sox9 and ovarian promoting genes, e.g., Dax1 and Foxl2. Thereby, Foxl2 was identified as a potential WT1 target gene. Antisense silencing of GATA4 led to the up regulation of Fst and Ctnnb1, which are identified as potential GATA4 target genes, that are repressed by GATA4. Interestingly, changes that were observed in the sole knockdown approach were prevented by the combined knockdown of WT1 and GATA4. This concludes a complex interplay between WT1 and GATA4 that control gonadal gene expression. Furthermore, Wt1 vivo-morpholino silencing affected the proliferation state of gonadal and mesonephric cells in both sexes. Treated gonads with Gata4 vivo- morpholino exhibit proliferation defects only in the male gonad and mesonephros, whereas the female organ was unaffected. In addition, I could demonstrate that modulation of theWnt signalling cascade does not interfere with the expression of Wt1 and Gata4, which suggests that WT1 and GATA4 act upstream of the Wnt pathway. In summary, I could show that WT1 and GATA4 are equally important during sex differentiation of the female and male gonad by contributing to a sex specific expression pattern.
Die abnorme Regulation bestimmter Faktoren, die bei der Gonadenentwicklung eine wichtige Rolle spielen, ist die Ursache für eine Vielzahl an Syndromen, die mit "disorders of sexual development (DSDs)", assoziiert sind. WT1 und GATA4 sind zwei wichtige Transkriptionsfaktoren während der Gonadenentwicklung. Die funktionelle Relevanz beider Faktoren ist während der Geschlechtsfestlegung gut erforscht. Das Wissen hingegen über deren Beitrag zur Entwicklung der weiblichen und männlichen Gonade im Laufe der Geschlechtsdifferenzierung verblieb etwas flüchtig. Dies konstantiert den zentralen Fokus der Doktorarbeit. Um diese Aufgabe zu bearbeiten, wurden die Gonaden von Wildtyp Wt1+/+ und Wt1-/- defizienter Mausembryonen miteinander, im Bezug auf die Morphologie und Genexpression, verglichen. Weiters etablierte ich ein ex-vivo Organkultursystem, welches sich aus einer hängenden Tröpfchenkultur und dem Einsatz von vivo-morpholinos gegen WT1 und GATA4 gerichtet, zusammensetzt. Dieses System ermöglicht die Analyse der Genexpression und Morphologie in einzelnen Gonadenkulturen. Die Daten zeigen, dass WT1 für eine sex-spezifische Signatur in beiden Geschlechter eine wichtige Rolle spielt. Der Knockdown von WT1 in ex-vivo Organkulturen bringt eine Abnahme in der Expression männlicher Gene, das heisst, Amh, Amhr2, Sf1 und Sox9 sowie weiblicher Gene, das heisst, Dax1 und Foxl2, mit sich. Dabei wurde Foxl2 als potentielles WT1 Zielgen identifiziert. Der GATA4 Knockdown führte zu einer Hochregulierung von Fst und Ctnnb1, welche somit als potentielle GATA4 Zielgene identifiziert werden konnten. Interessanterweise sind Veränderungen die im WT1 Einzelknockdown verzeichnet wurden, durch den kombinierten Knockdown von WT1/GATA4 kompensiert worden. Dies lässt folgern, dass WT1 und GATA4 in einem komplexen Zusammenspiel die gonadale Genexpression steuern. Darüberhinaus bewirkte der WT1 Knockdown in beiden Geschlechtern eine Abnahme in der Proliferation gonadaler und mesonephros-spezifscher Zellen. Gonaden, die mit Gata4 vivo-morpholino behandelt wurden, weissen ausschliesslich auf eine Proliferationsabnahme in der männlichen Gonade und dem Mesonephros hin, wohingegen die Proliferation im weibliche Organ unbeeinflusst blieb. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass eine Modulation des Wnt Signalwegs die Expression von Wt1 und Gata4 nicht beeinflusst. Die lässt die Annahme zu, dass möglicherweise WT1 und GATA4 dem Wnt Signalweg vorangeschaltet sind. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass WT1 und GATA4 eine ebenso wichtige Rolle während der Geschlechtsdifferenzierungs-phase der weiblichen sowie der männlichen Gonade einnehmen, und einen wichtigen Beitrag zu einer Geschlechts-spezifischen Signatur beisteuern.
