Tumorspezifische Toxine sind vielversprechende Substanzen auf dem Gebiet zielgerichteter Tumortherapie und scheitern dennoch oft an Dosis limitierenden unspezifischen Nebenwirkungen. In diesem Zusammenhang haben sich Saponine (pflanzliche Triterpenoide) sehr effektiv gezeigt. Die Saponinmischung Saponinum album (SA) hat in vitro und in vivo die Toxizität des chimären Toxins (Sap-3)-EGF (Saporin gebunden an den Epidermal Growth Factor), genannt SE, verstärkt und dessen therapeutische Dosis drastisch reduziert. Für den klinischen Einsatz eignet sich die undefinierte Saponinmischung SA jedoch nicht. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit die zwei analytisch reinen ‒ zuvor mithilfe von High Performance Liquid Chromatography (HPLC) aus den Wurzeln von Saponaria officinalis isolierten ‒ Saponine SO‑1861 und SO‑1731 eingesetzt. Zunächst wurde die Kombinationstherapie aus Reinsaponin und SE an TSA-EGFR-Zellen (murine Zelllinie mit Überexpression des EGF- Rezeptors) in vitro getestet. Mittels Endpunkt-Assays mit MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) wurde eine mehr als 100 000 fache Verstärkung der SE-Toxizität durch jedes der Saponine ermittelt. An BALB/c Mäusen wurde die akute In-vivo-Toxizität von SO‑1861 und SO‑1731 getestet. Anschließend wurden nicht toxische Dosen der beiden Reinsaponine (15 und 30 µg/Therapieeinheit) im syngenen Mausmodell, BALB/c-Mäusen mit Tumoren aus TSA-EGFR-Zellen, eingesetzt. Die achtmalige Therapie der Kombination von SE sowohl mit SO‑1861 als auch mit SO‑1731 führte zu einer signifikanten Reduktion des Tumorvolumens (p < 0,05): In der unbehandelten Kontrollgruppe hatten 5 von 8 Mäusen einen Tumor von > 450 mm³ und lediglich eine Maus zeigte spontane Tumorremission. Im Gegensatz dazu wiesen nach achtfacher Behandlung mit SO‑1861 (30 µg) und SE (0,1 µg) 6 von 10 Mäusen komplette Tumorremission auf und lediglich eine Maus hatte einen Tumor von > 450 mm³. Nach Kombinationstherapie mit SO‑1731 kam es sogar in allen Fällen zur vollständigen Remission. Erstmalig wurde mithilfe eines Impedanz basierten Echtzeit-Assays die Kinetik zytopathogener Effekte der Kombinationstherapie untersucht. Niedrigere effektive Toxinkonzentrationen (0,003 and 0,03 nM) führten zunächst zur Zellproliferation von HeLa-Zellen (humane Zervixkarzinomzellen, die eine Überexpression des EGFRs aufweisen) und dann zum allmählichen Zelltod innerhalb von 96–120 Stunden. Höhere effektive Toxinkonzentrationen (3 nM) führten bereits innerhalb der ersten 12 h zum schnellen nahezu vollständigen Tod der Zellverbände. Diese Information ist von großer Relevanz für die In-vivo-Applikation der Therapie, da dort vermutlich nur eine kurze Expositionszeit gegenüber SE und Saponin gewährleistet wird.
Targeted toxins are very promising agents in the field of tumor specific therapy. They are, however, accompanied by dose-limiting non-specific side effects. Certain plant derived triterpenoids, saponins, are very effective agents in this context. In the past, the saponin mixture saponinum album (SA) has, in vitro and in vivo, drastically enhanced the specific toxicity of the targeted toxin (Sap-3)-EGF (saporin fused to epidermal growth factor), called SE. However, the undefined raw mixture SA is not suitable for clinical use. In the present work, therefore, two pure Saponins, SO‑1861 and SO‑1731, isolated from the roots of Saponaria officinalis by a preparative high-performance liquid chromatography (HPLC), were tested in vitro and in vivo. Their combination effect with SE was tested in cytotoxicity assays on TSA-EGFR cells (a murine cell line overexpressing the epidermal growth factor receptor (EGFR)). Via endpoint assays with MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) an enhancement factor of > 100 000 could be observed when the toxin was applied together with either of the two saponins. SO‑1861 and SO‑1731 were tested for acute toxicity in BALB/c mice. Thereafter, nontoxic concentrations (15 and 30 µg/treatment) of the pure saponins were used in a syngeneic tumor model, BALB/c-mice bearing TSA-EGFR tumors. The combination of SE with SO‑1861 or alternatively SO‑1731 lead to a significant (p < 0,05) reduction of tumor volume: 5 out of 8 mice in the untreated control group had a tumor of > 450 mm³ and only one mouse showed spontaneous tumor remission. In contrast, after eightfold treatment with 30 µg SO‑1861 and 0,1 µg SE, 6 out of 10 mice showed complete tumor remission and only one had a tumor of > 450 mm³. The combination therapy comprising SO‑1731 even lead to complete tumor remission in all cases. With impedance based real- time-monitoring the kinetics of cytopathic effects of the combination therapy was observed for the first time. At lower effective toxin concentrations in the cell-culture (0,003 and 0,03 nM) HeLa cells (human cervix carcinoma cells overexpressing the EGFR) first proliferated and then gradually died within 96‒120 h whereas at higher effective concentrations (3 nM) almost complete cell death occurred within the first 12 h after application. This result is important to establish a better dose regimen for in vivo experimentation, where the tumor cells are exposed only a short time to the toxin and the saponin.
