To prevent anti-D immunization during pregnancy through the transplacental haemorrhaging of fetal erythrocytes in D-negative women, antenatal and postnatal anti-D prophylaxis is applied routinely in many countries, including Germany. However, anti-D is frequently not indicated. In a predominantly Caucasian population, 15-18 % of all pregnancies occur in D-negative women. In about 40% of all these cases the fetus is D-negative and antenatal anti-D prophylaxis is applied unnecessarily. Consequently, it would be beneficial if a method (especially a high-throughput method) was available for determining the fetal D type in all D-negative pregnant women. Since Lo Y.M. reported that fetal DNA was present and could be detected in maternal plasma in 1997 (Lo YM. et al. 1997), many researchers have started to investigate the fetal RhD status from fetal DNA extracted from the maternal plasma. However, the amount of fetal DNA is rather low, especially early in gestation, and this kind of research is therefore facing a huge challenge. In this thesis, two methods were developed for extracting fetal DNA from maternal plasma. Firstly, the QIAamp DSP Virus Kit (Qiagen) was optimized to extract fetal DNA from maternal plasma. The 95% detection limit was determined at 138 pg/ml (21 geq/ml). Secondly, a hybridization capture method combined with magnetic particles (HCMP) was developed using specific hybridization primers for the extraction of fetal DNA. The HCMP method was automated by adapting a commercially available liquid handling robot. The 95% detection limit was determined at 286 pg/ml (43 geg/ml). In order to evaluate the two optimized methods, an international survey on the extraction of fetal DNA from maternal plasma was held. The highest yield was obtained by the optimized QIAamp DSP Virus extraction method, higher than the frequently used QIAamp DNA Blood Mini Kit. Among the automated methods the HCMP method showed results comparable with other instruments evaluated. Key Words: Fetal DNA, RhD, noninvasive prenatal diagnosis, enrichment, high-throughput, hybridization capture, magnetic particles
Um eine Immunisierung Rh(D)-negativer Frauen durch diaplazentar übertragene fetale Erythrozyten während der Schwangerschaft zu vermeiden, wird in vielen Ländern, einschließlich Deutschland, eine ante- bzw. postpartale Anti-D-Immunprophylaxe durchgeführt. Diese Anti-D-Gabe ist jedoch häufig nicht indiziert. Dies resultiert aus dem Umstand, dass in einer vorwiegend kaukasisch geprägten Population 15-18% aller Schwangerschaften Rh(D)negative Frauen umfassen. In etwa 40% dieser Schwangerschaften ist der Fetus Rh(D)-negativ und daher keine Anti-D-Immunprophylaxe erforderlich. Insofern ist es sinnvoll, eine möglichst automatisierte Methode zu entwickeln, die den fetalen Rh(D)-Faktor zuverlässig ermitteln kann. Seit Y.M. Lo im Jahr 1997 berichtete, dass fetale DNA in mütterlichem Plasma vorhanden und nachweisbar war, haben viele Arbeitsgruppen versucht den fetalen Rh(D)-Status aus diesem Material zu bestimmen. Als limitierender Faktor erwies sich dabei die geringe Konzentration an fetaler DNA, insbesondere in der frühen Schwangerschaft, so dass die Entwicklung zuverlässiger Methoden eine große Herausforderung an die wissenschaftliche Arbeit darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Methoden der Extraktion fetaler DNA aus mütterlichem Plasma entwickelt. Primär wurde der QIAamp DSP Virus-Extraktionskit (Qiagen) für diesen Zweck soweit optimiert, dass eine Nachweisgrenze (95% detection limit) von 138 pg/ml bzw. 21 geq/ml erreicht wurde. Danach wurde unter Verwendung von spezifischen Hybridisationsprimern für die Extraktion fetaler DNA eine Hybridisierungs- Capture-Methode mit magnetischen Partikeln (HCMP) kombiniert und unter Benutzung eines adaptierten Pipettierroboters automatisiert. Die Nachweisgrenze (95% detection limit) lag hier bei 284 pg/ml bzw. 43 geq/ml. Im Rahmen eines internationalen Workshops wurden die Methoden evaluiert und die im Rahmen der vorliegenden Arbeit optimierte QIAamp DSP-Virus- Extraktionsmethode gegenüber der häufiger eingesetzten QIAamp DNA Blood Mini Kit Methode als sensitiver und damit diagnostisch effizienter bewertet. Die automatisierte HCMP-Methode wurde im Vergleich zu anderen Automatisationskonzepten als gleichwertig eingestuft.
