Most biological processes depend on finely tuned protein-protein interactions (PPI) that are mediated by small modular protein domains. PDZ (PSD95/Disc large/Zonula occludens-1) domains interact with small mostly C-terminal peptide sequences of interactions partners. PDZ-mediated interactions are implicated in several diseases, including many types of cancers. Therefore, small molecules that block these interactions represent a potential therapeutic approach. In this work, small molecule inhibitors of Dvl PDZ and AF-6 PDZ with an affinity of up to 2.4 µM and 62.2 µM are reported respectively. “Hits” for Shank-3 PDZ and PSD95-2 PDZ are also reported. Dishevelled (Dvl) proteins are important regulators of the Wnt signaling pathway that is implicated in human cancers. In the Wnt signaling pathway, Dvl PDZ interacts with Frizzled receptors to facilitate the propagation of the Wnt signal leading eventually to turmorigenesis. Small molecules that disrupted interactions between Dvl PDZ and Frizzled are reported in the first part of this work, where a specially designed library of 212 compounds for PDZ was screened against Dvl-3 PDZ by two-dimensional 1H -15N-HSQC. The first round of screening resulted in the identification of two series of scaffold compounds, the adamantane scaffold and the sulfonamide scaffold. To optimize the binding affinity of the adamantane scaffold, further extensions were designed to facilitate the creation of new interactions with the carboxylate binding loop region of Dvl-3 PDZ. The binding improved from KD = 190 µM for the initial hit to KD = 45 µM for compound 11 (2-((1S,3R,5S)-adamantan-1yl)-2-(2-(furan-2- carboxamido)-3-methylbutamid)acetic acid). A crystal structure of Dvl-3 PDZ in complex with compound 11 was solved. It revealed the importance of the adamantane moiety that points to the hydrophobic pocket of Dvl-3 PDZ. Compound 19 (4-methyl-2-(5,6,7,8-tetrahydronaphthalene-2- sulfonamido)hexanoic acid) was identified as the best among the tested sulfonamide scaffolds. Modifications to compound 19 resulted in compounds 36 with KD = 81 µM and 37 with KD = 84 µM. The x-ray structure of Dvl-3 PDZ in complex with compounds 36 and 37 were solved with a resolution of 1.43 Å for 36 and 1.6 Å for 37, respectively. Optimizations were undertaken yielding a new series of compounds. The binding constant of these compounds ranged from 9.4 µM to 59.5 µM. Compounds 61, 64 and 76 were the best binders for Dvl-3 PDZ and bind more tightly to Dvl-1 PDZ with the binding constants down to 2.4 µM. Competition assays revealed that the most tightly binding compound 61 and the Dpr peptide compete for the same site on the surface of Dvl PDZ domain. Compounds 61, 64 and 76 inhibit the Wnt signaling pathway as demonstrated by cell based assays. The second part of the work concerns the AF-6 PDZ domain. The structure of AF-6 PDZ in complex with compound 81 (5-(4-trifluoromethylbenzyl)-2-thioxo-4-thiazoline) resulted in the synthesis of new derivatives with an improved binding constant down to 62.2 µM. Five other PDZ domains including Shank-3 PDZ, PSD95-1 PDZ, PSD95-2 PDZ PSD95-3 PDZ and α-Syn PDZ were further explored with our library of small molecules created in the course of this work. Compound 101h was detected as a “hit” scaffold for Shank-3 PDZ and compound 101j as “hit” scaffold for PSD95-2 PDZ.
Eine Vielzahl biologischer Prozesse ist abhängig von fein abgestimmten Protein-Protein Interaktionen (PPIs), welche durch kleine modulare Proteindomänen vermittelt werden. PDZ (PSD95/Disc large/Zonula occludens-1)-Domänen interagieren mit kurzen, meist Carboxy-terminalen (C-terminalen) Peptidsequenzen bestimmter Proteine. PDZ vermittelte Wechselwirkungen sind bei mehreren Krankheiten, einschließlich zahlreicher Krebsarten, beteiligt. Aus diesem Grund stellen kleine Moleküle, die diese Interaktionen verhindern einen potenziellen therapeutischen Ansatz darf. In dieser Arbeit werden niedermolekulare Inhibitoren für die Dvl und AF-6 PDZ- Domänen mit einer Affinität von 2,4 µM beziehungsweise 62,2 µM vorgestellt. Kandidaten für die PDZ-Domänen von Shank-3 sowie PSD95-2 die im verlauf von selektivität untersuchungen gefunden werden, werden ebenfalls diskutiert. Dishevelled (Dvl) Proteine sind wichtig für die Regulation des Wnt- Signalweges. Dieser Signalweg ist in diversen humanen Krebserkrankungen involviert. Im Wnt-Signalweg interagiert die Dvl PDZ-Domäne mit Frizzled- Rezeptoren um die Übertragung des Wnt-Signals zu ermöglichen. Im ersten Teil dieser Arbeit werden kleine Moleküle vorgestellt, die in der Lage sind, die Interaktion zwischen der Dvl-PDZ-Domäne und dem Frizzled-Rezeptor zu stören. Für die Betrachtung dieses Aspekts wurde eine spezielle Bibliothek mit 212 Verbindungen für PDZ-Domänen konzipiert und die wechselwirkung dieser Substanzen mit der Dvl-3 PDZ-Domäne untersucht. Das erste Screening ermöglichte die Identifizierung von zwei Serien von Verbindungen, die jeweils ein einheitliches Grundgerüst aufweisen, und entweder eine Adamantan- oder Sulfonamid-Gruppe enthalten. Für die Optimierung der Bindungsaffinität der Adamantan-Verbindungen wurde das Grundgerüst so erweitert, dass neue Interaktionen mit der Carboxylatbindungsstelle der Dvl-3 PDZ-Domäne ermöglicht werden. Die Bindungsaffinität der beschriebenen Liganden verbesserte sich von KD = 190 µM für den ersten Hit auf KD = 45 µM für die Verbindung 11(2 - ((1S, 3R, 5S)-Adamantan-1-yl) -2 - (2 - (Furan-2-carboxamido)-3-methylbutamid) essigsäure Für diese Verbindung im Komplex mit der PDZ-Domäne von Dvl-3 wurde eine Kristallstruktur gelöst. Mit Hilfe dieser Kristallstruktur konnte gezeigt werden, dass die Adamantan-Gruppe die hydrophobe Bindungstasche der Dvl-3 PDZ Domäne ausfüllt. Aus der Sulfonamid-Serie konnte Verbindung 19 (4-Methyl-2-(5,6,7,8-Tetrahydronaphthalin-2-sulfonamido) Hexansäure) als beste Substanz identifiziert werden. Modifikationen dieser Verbindung führten zu Verbindung 36 mit KD = 81 µM und 37 mit KD = 84 µM. Die Kristallstrukturen der Dvl-3 PDZ-Domäne im Komplex mit den Verbindungen 36 beziehungsweise 37. Optimierungsschritte nahe die zu einer weitere Reihe von Verbindungen Fürhten. Die Bindungskonstanten dieser Verbindungen bewegen sich zwischen 9,4 µM und 59,5 µM. Die Verbindungen 61, 64 und 74 zeigten die beste Affinität für die Dvl-3 PDZ-Domäne und binden noch stärker an die Dvl-1 PDZ-Domäne mit Bindungskonstanten bis zu 2,4 µM. Kompetitionsassays zeigten, dass die bestbindende Verbindung 61 mit dem Dpr Peptid um dieselbe Bindungsstelle auf der Oberfläche der Dvl PDZ-Domäne konkurriert. Mittels eines zellbasierten Assays konnte gezeigt werden, dass die Verbindungen 61, 64 und 76 den Wnt- Signalweg inhibieren. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der AF-6 PDZ-Domäne. Die Struktur der AF-6 PDZ Domäne im Komplex mit Verbindung 81 (5 - (4-trifluormethylbenzyl)-2-thioxo-4-Thiazolin) führte zur Synthese neuer Derivate mit verbesserten Bindungskonstanten bis zu 62,2 µM. Im Zuge dieser Arbeit wurden fünf weitere PDZ-Domänen, darunter Shank-3 PDZ, PSD95-1 PDZ, PSD95-2 PDZ, PSD95-3 PDZ und α-Syntrophin PDZ mit der Bibliothek der niedermolekularen Substanzen untersucht. Dabei konnten die Verbindung an 101h für die Shank-3 PDZ-Domäne sowie 101j für die PSD95-2 PDZ-Domäne als gute Kandidaten für weitere Optimierungen ermittelt werden.
