Synaptic communication between neurons is tuned by a variety of presynaptic G-protein coupled receptors. Many of these receptors act inhibitory, as they decrease neurotransmitter release, and thereby lower the gain of synaptic transmission. Ligand binding to these presynaptic receptors causes activation of intracellular heterotrimeric G-proteins. The G-protein Gβγ subunits can interact with presynaptic voltage-dependent calcium channels and lower the channels’ opening probability. This results in a decrease of calcium influx after an action potential and ultimately reduces the amount of neurotransmitter release. Additionally, a second signalling pathway has been suggested that reduces transmitter release independently of voltage-dependent calcium channels, but its molecular mechanisms have not yet been clarified. To gain more insight into this potential second inhibitory signalling pathway, we studied inhibition of glutamate release by presynaptic metabotropic γ-aminobutyric acid receptors (GABABRs). We found that at Schaffer collateral synapses in CA1 of the hippocampus, the reduction of calcium influx by GABABRs does not sufficiently account for the observed reduction of transmitter release, and that GABABRs can also decrease transmitter release rates in calcium-free conditions. In autaptic cell cultures of hippocampal neurons, we used hypertonic solutions to trigger transmitter release in a calcium- independent manner. Here too, GABABR activation inhibits transmitter release. These results argue for a second inhibitory mechanism that acts directly at the vesicular release machinery and increases the energy barrier for vesicle fusion. The carboxy-terminus of SNAP-25, one of the proteins forming the core release apparatus, has been implicated as a target of G-protein-mediated direct inhibition of vesicle fusion. We tested this hypothesis by cleaving off the carboxy-terminus of SNAP-25 with Botulinum neurotoxin A. However, this treatment did not abolish the calcium channel-independent inhibitory effect of presynaptic GABABRs, indicating that Gβγ subunits of inhibitory G-proteins interact with another, yet unknown part of the release machinery. We also found evidence for calcium channel-independent inhibition by GABABRs at hippocampal mossy fibre synapses in CA3. In order to study these synapses in a cell culture model, we established autaptic cultures of hippocampal granule cells, and describe their morphological and physiological features in detail. We further investigated presynaptic inhibition by expressing an artificial G-protein coupled receptor in autaptic neurons. An artificial, pharmaco- genetic system to silence transmitter release is potentially useful for studying the role of neuronal populations in networks in vivo. Ongoing work aims to generate a transgenic mouse line that would allow restricting presynaptic inhibition to genetically defined neuronal populations.
Synaptische Informationsübertragung zwischen Neuronen wird durch präsynaptische, G-Protein gekoppelte Rezeptoren moduliert. Viele dieser Rezeptoren wirken inhibitorisch, da sie die Neurotransmitter Freisetzung verringern, und somit die synaptische Signalweiterleitung dämpfen. Ligandenbindung an diese Rezeptoren aktiviert intrazelluläre, heterotrimere G-Proteine. Deren Gβγ-Untereinheiten können mit spannungsgesteuerten Calciumkanälen interagieren und dadurch die Öffnungswahrscheinlichkeit der Kanäle verringern. Dies bedingt einen verringerten Calciumeinstrom nach einem Aktionspotential, was wiederum eine Verringerung der Transmitterfreisetzung zur Folge hat. Zusätzlich wird eine weitere Signalkaskade vermutet, welche die Transmitterfreisetzung unabhängig von spannungsgesteuerten Calciumkanälen hemmen soll, deren molekularer Mechanismus zum gegenwärtigen Zeitpunkt aber noch nicht eindeutig identifiziert ist. Um mehr über diese potentielle Signalkaskade zu lernen, untersuchten wir die Inhibition der Glutamatausschüttung durch präsynaptische, metabotrope Rezeptoren für γ-Aminobuttersäure (engl. “γ-aminobutyric acid“, GABABR). Wir fanden an den Synapsen der Schaffer-Kollateralen in CA1 des Hippocampus, dass die Reduktion des Calciumeinstroms nach Aktivierung der GABABR nicht die gesamte beobachtete Verringerung der Glutamatfreisetzung erklären kann, und dass GABABR auch in Calcium-freien Bedingungen die spontane Freisetzungsrate von Glutamat verringern. In autaptischen Zellkulturen hippocampaler Neurone benutzten wir hypertone Lösungen um eine Calcium unabhängige Glutamatausschüttung auszulösen. Auch hier verringerte eine GABABR Aktivierung die Transmitterfreisetzung. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines zweiten inhibitorischen Mechanismus, der direkt an der synaptischen Freisetzungsmaschinerie ansetzt und dadurch die Energiebarriere für die Vesikelfusion erhöht. Als möglicher Angriffspunkt G-Protein vermittelter direkter Inhibition der synaptischer Vesikelfusion wurde der Carboxy-Terminus von SNAP-25 vorgeschlagen, einem Molekül der vesikulären Freisetzungsmaschinerie. Wir testeten diese Hypothese, indem wir das Carboxy- Ende von SNAP-25 mittels Botulinum Toxin A abspalteten. Allerdings hob diese Manipulation nicht die Calciumkanal unabhängige Inhibition durch präsynaptische GABABR auf, was vermuten lässt, dass die Gβγ-Untereinheiten der inhibitorischen G-Proteine mit einer anderen, noch nicht identifizierten Komponente der Freisetzungsmaschinerie interagieren. Darüber hinaus fanden wir positive Evidenzen für eine Kalzium-Kanal unabhängige Inhibition durch GABABR an hippocampalen Moosfasersynapsen in CA3. Um diese Synapsen im Zellkulturmodell untersuchen zu können, etablierten wir autaptische Zellkulturen von hippocampalen Körnerzellen, deren morphologische und physiologische Charakteristika wir detailliert beschreiben. Wir haben des Weiteren präsynaptische Inhibition durch einen artifizielle G-Protein gekoppelte Rezeptor in autaptischen Neuronen untersucht. Ein künstliches, pharmako-genetisches System zur Inhibition der Transmitterfreisetzung kann potentiell nützlich sein zur Untersuchung der Rolle einzelner Neuronenpopulationen im Netzwerk in vivo. Laufende Arbeiten streben nun die Entwicklung einer transgenen Maus an, um präsynaptische Inhibition auf einzelne, genetisch definierte Neuronengruppen zu beschränken.
