Einfluss von Produkten der Maillard-Reaktion und Salzen kurzkettiger Fettsäuren auf die Aktivität und Expression des Effluxtransporters P-Glykoprotein: In vitro-Untersuchungen an den humanen Kolonkarzinomzelllinien Caco-2 und LS180

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aminosäuren jeweils mit Glucose, Fructose oder Lactose kombiniert und deren Lyophilisate nach dem Protokoll der COST-Action 919 für 2 h bei 125 °C erhitzt. Die auf diesem Wege gewonnen Maillard-Reaktionsprodukte (MRPs) wurden in wasserlösliche und ethanollösliche Verbindungen fraktioniert und auf inhibierende und induzierende Fähigkeiten bezüglich des Effluxtransporters P-Glykoprotein (P-gp) an den Kolonkarzinomzelllinien Caco-2 und LS180 getestet. Als Modell-P -gp-Substrat diente der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 (RH). Eine Inhibition des P-gp seitens der hergestellten MRPs konnte sowohl im RH 123-Akkumu­lationstest als auch in bidirektionalen Transportstudien an Caco-2-Monolayern nicht ermittelt werden. Eine Inkubation der LS180-Zellen mit den hergestellten MRPs für 48 h führte im RH 123-Akkumulationstest zu einer Reduktion der intrazellulären RH 123-Konzentration gegenüber unbehandelten Zellen. Dieser für LS180-Zellen spezifische Effekt trat lediglich bei den wasserlöslichen MRPs der Aminosäuren Arginin, Serin und Prolin auf. Die deutlichste Absenkung der intrazellulären RH 123-Konzentration konnte mit dem MRP-Gemisch Glucose-Prolin (Glc-Pro) erreicht werden. Der nicht-kompetitive P -gp-Inhibitor Elacridar vermochte den erniedrigten RH 123-Zellinhalt von 65 % infolge einer Inkubation mit Glc-Pro auf 88 % zu steigern. Zur Klärung, ob die Reduktion der RH 123-Akkumulation auf einen gesteigerten P-gp-Efflux des Modell-Substrats RH 123 zurückzuführen sei, wurde der P-gp-Proteingehalt von Caco-2- und LS180-Zelllysaten nach einer Inkubation für 48 h mit ausgewählten wasserlöslichen MRPs bestimmt. Mittels Western Blot konnte gezeigt werden, dass ausschließlich wasserlösliche MRP-Gemische mit Prolin als Aminosäurekomponente die P-gp-Proteinmenge in LS180-Zellen steigerten. LS180-Zellen exprimieren im Gegensatz zu Caco-2-Zellen den Pregnan X-Rezeptor (PXR), den Schlüsselrezeptor für die P-gp-Expression, so dass die erhöhte P -gp-Proteinmenge das Resultat einer Induktion der P-gp-Expression über PXR darstellen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Natriumsalze kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs) der Kettenlänge C1 bis C6 auf die Aktivität des P-Glykoproteins untersucht. Auch hier konnte keine Inhibition des P-Glykoproteins anhand von in vitro-Zellkulturtests registriert werden. Jedoch nahmen Na-Propionat (C3), Na-Butyrat (C4), Na-Valeriat (C5) und Na- Isovaleriat (C5) Einfluss auf die P-Glykoprotein-Expression. Mehrere Ergebnisse sprechen dafür. Im RH 123-Akkumulationstest führten diese Salze zu einer Verringerung der RH 123-Akkumulation in Caco-2- und LS180-Zellen nach 48 h-Inkubation. Das Natriumsalz der C4-Fettsäure übte den stärksten Effekt auf die RH 123-Akkumulation aus. Die Kombination der Salze führte nicht zu einer Effektsteigerung, sondern schwächte den Effekt hingegen eher ab. Eine Zellzyklusuntersuchung von Caco-2- und LS180-Zellen registrierte einen G1 -Phase-Arrest, ausgelöst durch eine 48 h-Inkubation mit Na-Propionat, Na- Butyrat, Na-Valeriat und Na-Isovaleriat. G1-Phase-Arreste können ein Indiz für das Auslösen einer Zelldifferenzierung darstellen, die mit einer verstärkten P -gp-Expression einhergehen kann. Darüber hinaus wurden die P-gp-Proteinmengen in Caco-2- und LS180-Zellen bestimmt. Na-Propionat, Na-Butyrat, Na-Valeriat und Na-Isovaleriat vermochten sowohl in Caco-2- als auch in LS180-Zellen die P -gp-Proteinmengen nach einer Inkubation für 48 h zu steigern. Die Induktion der P-gp-Expression, die sich in einem verstärkten Efflux des P-gp-Substrats RH 123 äußerte, ist nicht wie bei Glc-Pro auf eine Aktivierung des PXR zurückzuführen. Stattdessen ist von einer Stimulation der P-gp-Expression über den Vitamin D-Rezeptor auszugehen, der bei beiden Zelllinien vorliegt. Die übrigen Salze der SCFAs Na-Formiat, Na-Acetat, Na-Isobutyrat und Na-Capronat zeigten keinen Einfluss auf das P-gp.

Maillard reaction products (MRPs) arise from complex reactions between amino acids or proteins and reducing sugars in vivo as well as during food processing. Numerous studies have shown that MRPs are beneficial compounds, due to their antioxidant, chemopreventive and probiotic effects. On the other side certain MRPs revealed harmful effects like cytotoxicity, carcinogenicity and mutagenicity. To date no knowledge exists, if MRPs are able to modulate P-Glycoprotein (P-gp) activity or to induce P-gp expression. Within this dissertation different model MRPs were formed by using the protocol of COST Action 919 and fractionated into water soluble and ethanol soluble MRPs. To assess the functional activity of P-glycoprotein the fluorescent dye Rhodamine 123 (RH 123) was used as a model P-gp substrate. The colon cell lines Caco-2 and LS180 were exposed to model MRPs for 48 h and subsequent changes in RH 123 accumulation were measured. In contrast to Caco-2 cells LS180 cells only express P-gp after treatment with inducers of P-gp expression. Following treatment with model MRPs a reduced uptake of P-gp substrate RH 123 could be observed only by certain water soluble model MRPs. Among them Glucose-Prolin (Glc-Pro) showed the strongest influence on cellular uptake. This effect appeared merely in LS180 cells in a time dependend manner and could be reversed by the potent P-gp inhibitor Elacridar. The influence of water soluble MRPs on the P-gp expression of Caco-2 and LS180 cells was determined by Western Blotting. A 48 h incubation of LS180 cells revealed an enhanced P-gp protein amount only in Glc-Pro treated cells in contrast to untreated cells. These findings demonstrate that the reduced RH 123 accumulation by water soluble MRPs of Glc-Pro could be explained by an induced expression of P-gp. In comparison to Caco-2 cells LS180 cells exhibit the Pregnane X receptor (PXR), the key receptor for inducing P-gp expression. Consequently water soluble MRPs of Glc-Pro assumedly induce P-gp expression with participation of PXR. In contrast none of the model MRPs showed an inhibition of P-gp in RH 123 accumulation studies and transport studies with Caco-2 monolayer. The second purpose of this dissertation was to examine the ability of short chain fatty acids (SCFAs) to modulate P-gp activity or to induce P-gp expression. SCFAs are the main products of colonic microbial fermentation of carbohydrates. SCFAs especially Butyrate are involved in processes of cell proliferation, differentiation and apoptosis. In RH 123 accumulation and transport studies with Caco-2 monolayer no inhibition of P-gp by SCFAs in various concentrations could be detected. However, Propionate, Butyrate, Valeriate and Iso­valeriate exhibited an influence of P-gp expression. These SCFAs were able to reduce the RH 123 accumulation after an incubation for 48 h in Caco-2 and LS180 cells. Furthermore Propionate, Butyrate, Valeriate and Isovaleriate induced growth arrest in Caco-2 and LS180 cells, that is often associated with differentiation including an enhanced P-gp expression. In addition to these findings P-gp protein levels were determined by Western Blotting after a 48 h exposure of SCFAs. Western Blot analysis confirmed that among the SCFAs only Propionate, Butyrate, Valeriate and Isovaleriate were able to induce P-gp expression. Enhanced P-gp protein contents could be observed in both colon cell lines. This implicated a role of the Vitamin D receptor (VDR) in SCFA-induced P-gp expression. In all investigations Butyrate was most effective, whereas Formiate, Acetate, Isobutyrate and Capronate showed no effects according P-gp.