dc.contributor.author
Freyer, Nora
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:15:14Z
dc.date.available
2018-06-01T08:55:07.921Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10244
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14442
dc.description.abstract
The derivation of hepatocytes from human induced pluripotent stem cells
(hiPSC) represents a promising alternative to primary human hepatocytes (PHH)
for potential applications in cell therapies or drug toxicity testing using in
vitro models. To date, hiPSC-derived hepatocytes still show an immature
phenotype when compared to PHH. The aim of this thesis was to optimize culture
conditions for the hepatic differentiation of hiPSC to improve their
functionality. In the first step the hepatic differentiation was transferred
to a perfused 3D bioreactor to create a more physiological culture
environment. Therefore, two different differentiation protocols and hiPSC
lines were applied and the differentiation outcome was compared to static 3D
spheroids and 2D cultures. The maturation state was analyzed with respect to
gene and protein expression of hepatic markers as well as activity of
different pharmacologically relevant cytochrome P450 (CYP) isoenzymes, using
PHH as reference cells. The results of both differentiation protocols and cell
lines indicate a higher maturation of hiPSC-derived hepatocytes in 3D
bioreactors compared with 2D cultures or 3D spheroids regarding secretion of
hepatic export proteins such as albumin or alpha-1-antitrypsin. In addition
increased activities of drug-metabolizing enzymes such as CYP1A2 or CYP2B6
were shown. Immunohistochemical studies revealed the formation of tissue-like
structures. However, the functionality of the differentiated cells from the 3D
bioreactor was still lower than in PHH cultures. In the second step the effect
of a co-culture with human endothelial cells on the hepatic maturation of
hiPSC-derived hepatocytes was investigated, since it was observed that
endothelial cells are important for the embryonic liver development prior to
vascularization. For this purpose, hepatic differentiation of hiPSC was
performed in 2D cultures in the presence or absence of human umbilical vein
endothelial cells (HUVEC) using culture media mixtures based on endothelial
cell and hepatocyte growth media. The use of the optimized co-culture media
resulted in distinctly increased CYP activities and mRNA expression of hepatic
markers such as hepatocyte nuclear factor 4 alpha regardless whether HUVEC
were present or not. In conclusion, the results emphasize the potential of the
bioreactor technology to support the hepatic maturation of hiPSC-derived
hepatocytes. The positive effect of a co-culture with endothelial cells
investigated in 2D cultures was outweighed by the effect of the optimized co-
culture media. Hence, the next logical step to combine the three studies of
the present thesis would be the investigation of HUVEC-hiPSC co-cultures
during hepatic differentiation in the 3D bioreactors.
de
dc.description.abstract
Die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC)
zu Hepatozyten stellt eine vielversprechende Alternative zu primären humanen
Hepatozyten (PHH) dar, die in Zelltherapien oder in der Medikamententestung
mit in vitro Modellen Anwendung finden könnte. Bisher zeigen aus hiPSC
gewonnene Hepatozyten im Vergleich zu PHH allerdings einen unreifen Phänotyp.
Das Ziel dieser Promotion war die Optimierung der Kulturbedingungen für die
hepatische Differenzierung von hiPSC, um deren Funktionalität zu verbessern.
Im ersten Schritt wurde die hepatische Differenzierung auf einen perfundierten
3D-Bioreaktor übertragen, um physiologischere Kulturbedingungen zu schaffen.
Dafür wurden zwei unterschiedliche Differenzierungsprotokolle und hiPSC-Linien
verwendet und das Differenzierungsergebnis mit statischen 3D-Spheroiden und
2D-Kulturen verglichen. Der Ausreifungsgrad wurde anhand der Gen- und
Proteinexpression hepatischer Marker und der Aktivität verschiedener
pharmakologisch relevanter Cytochrom-P450-Isoenzyme (CYP) im Vergleich zu PHH
beurteilt. Die im 3D-Bioreaktor differenzierten hiPSC wiesen mit beiden
Differenzierungsprotokollen und hiPSC-Linien eine erhöhte Sekretion
hepatischer Exportproteine wie Albumin oder Alpha-1-Antitrypsin auf. Außerdem
wurden gesteigerte Aktivitäten von Enzymen des Arzneimittelstoffwechsels wie
CYP1A2 oder CYP2B6 im Vergleich zu 3D-Spheroiden und 2D-Kulturen gemessen.
Mittels immunhistochemischer Untersuchungen wurde die Bildung gewebsähnlicher
Strukturen im 3D-Bioreaktor gezeigt. Allerdings war die Funktionalität auch
der im 3D-Bioreaktor differenzierten hiPSC geringer als die der PHH. Im
zweiten Schritt wurde der Einfluss einer Kokultur mit humanen Endothelzellen
auf die hepatische Ausreifung der hiPSC untersucht, da Endothelzellen bereits
vor der Vaskularisierung entscheidend für die embryonale Leberentwicklung
sind. Zu diesem Zweck wurde die hepatische Differenzierung von hiPSC in 2D-
Kulturen mit oder ohne Zugabe von human umbilical vein endothelial cells
(HUVEC) durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Mischungen aus endothelzell-
und hepatozytenspezifischen Kulturmedien verwendet. Die Zugabe der optimierten
Kokulturmedien führte zu einer deutlichen Erhöhung der CYP-Aktivitäten und der
mRNA-Expression hepatischer Marker wie hepatocyte nuclear factor 4 alpha,
unabhängig davon, ob HUVEC dazugegeben wurden oder nicht. Die Ergebnisse
lassen den Schluss zu, dass der Bioreaktor die hepatische Ausreifung der aus
hiPSC generierten Hepatozyten unterstützt. Die Untersuchungen zur Kokultur mit
Endothelzellen in 2D-Kulturen zeigten, dass der positive Effekt der
optimierten Kokulturmedien den Effekt der HUVEC-Kokultur selbst übertraf. Der
nächste logische Schritt, um die drei hier beschriebenen Studien zu verbinden,
wäre daher die Untersuchung einer Kokultur mit hiPSC und Endothelzellen
während der hepatischen Differenzierung im 3D-Bioreaktor.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
hepatic differentiation
dc.subject
endothelial cells
dc.subject
hepatocyte-like cells
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Optimizing culture conditions for hepatic differentiation of human induced
pluripotent stem cells
dc.contributor.contact
nora.freyer@charite.de
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2018-06-16
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000106777-9
dc.title.subtitle
from 3D culture systems to co-cultures
dc.title.translated
Optimierung der Kulturbedingungen für die hepatische Differenzierung von
humanen induzierten pluripotenten Stammzellen
de
dc.title.translatedsubtitle
von 3D Kultursystemen bis zur Ko-kultur
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000106777
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000023472
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access