The derivation of hepatocytes from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) represents a promising alternative to primary human hepatocytes (PHH) for potential applications in cell therapies or drug toxicity testing using in vitro models. To date, hiPSC-derived hepatocytes still show an immature phenotype when compared to PHH. The aim of this thesis was to optimize culture conditions for the hepatic differentiation of hiPSC to improve their functionality. In the first step the hepatic differentiation was transferred to a perfused 3D bioreactor to create a more physiological culture environment. Therefore, two different differentiation protocols and hiPSC lines were applied and the differentiation outcome was compared to static 3D spheroids and 2D cultures. The maturation state was analyzed with respect to gene and protein expression of hepatic markers as well as activity of different pharmacologically relevant cytochrome P450 (CYP) isoenzymes, using PHH as reference cells. The results of both differentiation protocols and cell lines indicate a higher maturation of hiPSC-derived hepatocytes in 3D bioreactors compared with 2D cultures or 3D spheroids regarding secretion of hepatic export proteins such as albumin or alpha-1-antitrypsin. In addition increased activities of drug-metabolizing enzymes such as CYP1A2 or CYP2B6 were shown. Immunohistochemical studies revealed the formation of tissue-like structures. However, the functionality of the differentiated cells from the 3D bioreactor was still lower than in PHH cultures. In the second step the effect of a co-culture with human endothelial cells on the hepatic maturation of hiPSC-derived hepatocytes was investigated, since it was observed that endothelial cells are important for the embryonic liver development prior to vascularization. For this purpose, hepatic differentiation of hiPSC was performed in 2D cultures in the presence or absence of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) using culture media mixtures based on endothelial cell and hepatocyte growth media. The use of the optimized co-culture media resulted in distinctly increased CYP activities and mRNA expression of hepatic markers such as hepatocyte nuclear factor 4 alpha regardless whether HUVEC were present or not. In conclusion, the results emphasize the potential of the bioreactor technology to support the hepatic maturation of hiPSC-derived hepatocytes. The positive effect of a co-culture with endothelial cells investigated in 2D cultures was outweighed by the effect of the optimized co- culture media. Hence, the next logical step to combine the three studies of the present thesis would be the investigation of HUVEC-hiPSC co-cultures during hepatic differentiation in the 3D bioreactors.
Die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) zu Hepatozyten stellt eine vielversprechende Alternative zu primären humanen Hepatozyten (PHH) dar, die in Zelltherapien oder in der Medikamententestung mit in vitro Modellen Anwendung finden könnte. Bisher zeigen aus hiPSC gewonnene Hepatozyten im Vergleich zu PHH allerdings einen unreifen Phänotyp. Das Ziel dieser Promotion war die Optimierung der Kulturbedingungen für die hepatische Differenzierung von hiPSC, um deren Funktionalität zu verbessern. Im ersten Schritt wurde die hepatische Differenzierung auf einen perfundierten 3D-Bioreaktor übertragen, um physiologischere Kulturbedingungen zu schaffen. Dafür wurden zwei unterschiedliche Differenzierungsprotokolle und hiPSC-Linien verwendet und das Differenzierungsergebnis mit statischen 3D-Spheroiden und 2D-Kulturen verglichen. Der Ausreifungsgrad wurde anhand der Gen- und Proteinexpression hepatischer Marker und der Aktivität verschiedener pharmakologisch relevanter Cytochrom-P450-Isoenzyme (CYP) im Vergleich zu PHH beurteilt. Die im 3D-Bioreaktor differenzierten hiPSC wiesen mit beiden Differenzierungsprotokollen und hiPSC-Linien eine erhöhte Sekretion hepatischer Exportproteine wie Albumin oder Alpha-1-Antitrypsin auf. Außerdem wurden gesteigerte Aktivitäten von Enzymen des Arzneimittelstoffwechsels wie CYP1A2 oder CYP2B6 im Vergleich zu 3D-Spheroiden und 2D-Kulturen gemessen. Mittels immunhistochemischer Untersuchungen wurde die Bildung gewebsähnlicher Strukturen im 3D-Bioreaktor gezeigt. Allerdings war die Funktionalität auch der im 3D-Bioreaktor differenzierten hiPSC geringer als die der PHH. Im zweiten Schritt wurde der Einfluss einer Kokultur mit humanen Endothelzellen auf die hepatische Ausreifung der hiPSC untersucht, da Endothelzellen bereits vor der Vaskularisierung entscheidend für die embryonale Leberentwicklung sind. Zu diesem Zweck wurde die hepatische Differenzierung von hiPSC in 2D- Kulturen mit oder ohne Zugabe von human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Mischungen aus endothelzell- und hepatozytenspezifischen Kulturmedien verwendet. Die Zugabe der optimierten Kokulturmedien führte zu einer deutlichen Erhöhung der CYP-Aktivitäten und der mRNA-Expression hepatischer Marker wie hepatocyte nuclear factor 4 alpha, unabhängig davon, ob HUVEC dazugegeben wurden oder nicht. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der Bioreaktor die hepatische Ausreifung der aus hiPSC generierten Hepatozyten unterstützt. Die Untersuchungen zur Kokultur mit Endothelzellen in 2D-Kulturen zeigten, dass der positive Effekt der optimierten Kokulturmedien den Effekt der HUVEC-Kokultur selbst übertraf. Der nächste logische Schritt, um die drei hier beschriebenen Studien zu verbinden, wäre daher die Untersuchung einer Kokultur mit hiPSC und Endothelzellen während der hepatischen Differenzierung im 3D-Bioreaktor.
