Functional and molecular characterization of the phylogenetically related ERF102 to ERF105 transcription factor genes in Arabidopsis thaliana

Abstract

The ETHYLENE RESPONSE FACTOR (ERF) genes of Arabidopsis thaliana form a large family encoding plant-specific transcription factors. In this work, four phylogenetically closely related ERF genes were characterized. These genes, ERF102 (AT5G47230; also known as ERF5), ERF103 (AT4G17490; identical to ERF6), ERF104 (AT5G61600) and ERF105 (AT5G51190) are members of group IXb of the ERF family. In the first part of this study, ERF102 to ERF105 were descriptively characterized. Transcriptional expression analyses revealed that ERF102 to ERF105 were regulated by a number of hormones as well as various abiotic stresses. Analyses of tissue-specific expressions using promoter:GUS reporter lines demonstrated similar but distinct expression patterns of ERF102:GUS to ERF105:GUS, which were particularly expressed in roots. ERF102-GFP to ERF105-GFP fusion proteins were nuclear localized. Protein interaction analyses indicate formation of homo- and heterodimers as well as interaction of all four ERF proteins with the MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE6 (MPK6). In order to examine the biological functions of ERF102 to ERF105, loss-of- function and gain-of-function mutants were analyzed regarding their growth phenotype under standard growth conditions. The loss-of-function of single ERF genes resulted in a slightly reduced plant growth, whereas overexpression of the ERF genes under control of the CaMV 35S promoter led to a slightly increased growth. The analysis of the growth phenotype of double mutants did not show a phenotypic additive effect compared to the respective single mutants. The results from the analyses of amino acid sequences, the transcriptional regulations, the tissue-specific expression patterns, protein interactions, the growth phenotypes as well as data published by others showed pleiotropic and thus overlapping functions of ERF102 to ERF105 in plant development and stress response. The second part of this study dealt with the more detailed functional characterization of ERF105, which has a particularly relevant role in the cold stress response. Expression analyses revealed that ERF105 is early and transiently upregulated by cold. In electrolyte leakage and plant survival tests, loss-of-function and gain-of-function (overexpressing) plants of ERF105 showed reduced and enhanced freezing tolerance, respectively. Consistent with the freezing tolerance phenotype, erf105 mutants showed a decreased expression of numerous cold-responsive genes, such as CBF1, CBF2 and CBF3 and several COR genes in non-acclimated plants as well as after cold acclimation at 4 °C. Based on the examined transcript data and protein interaction analysis with MPK6, ERF105 was suggested to be integrated in the CBF cold signaling pathway. ERF105 was tentatively positioned downstream of MPK6 and acting independent of ICE1 upstream of the CBF and COR genes, activating these genes directly and/or indirectly through repression of ZAT12. The increased freezing sensitivity of erf105 was not correlated with the concentrations of proline, soluble sugars or ABA, which typically accumulate during cold and function as, for instance, osmoprotectants or signaling molecules for regulating gene expression. However, an elevated ROS accumulation in erf105 could be detected before and after cold acclimation at 4 °C. Flavonoids are accumulated during cold as well and are associated with enhanced resistance to the effect of chilling and freezing, whereby flavonoids may function as antioxidants or membrane stabilizers. ERF105 probably contributes to the initiation of flavonoid biosynthesis by positively regulating the transcription factor genes MYB11, MYB12 and MYB111, which control and activate the early biosynthetic steps of flavonoid biosynthesis. Furthermore, ERF105 has been identified to be a positive regulator in the response to drought, osmotic, salt, and oxidative stress, but its precise molecular function in the response to these stress types needs to be determined yet.

Die ETHYLENE RESPONSE FACTOR (ERF) Gene in Arabidopsis thaliana kodieren für eine große pflanzenspezifische Transkriptionsfaktorfamilie. In dieser Arbeit wurden vier phylogenetisch eng verwandte ERF-Transkriptionsfaktorgene charakterisiert. Diese Gene sind ERF102 (AT5G47230; oder auch ERF5), ERF103 (AT4G17490; oder auch ERF6), ERF104 (AT5G61600) sowie ERF105 (AT5G51190), und sind der Gruppe IXb der ERF-Familie zugehörig. Der erste Teil dieser Arbeit bestand in der deskriptiven Charakterisierung von ERF102 bis ERF105. Analysen der Expression von ERF102 bis ERF105 zeigten, dass diese durch eine Vielzahl von Hormonen sowie verschiedene abiotische Stressarten reguliert wurden. Dies deutet darauf hin, dass diese Gene pleiotrope Funktionen erfüllen. Analysen der gewebespezifischen Expression unter Verwendung von Promotor:GUS- Reporterlinien offenbarten, dass ERF102:GUS bis ERF105:GUS einerseits ähnliche, aber auch distinkte Expressionsmuster aufwiesen und vor allem in der Wurzel exprimiert wurden. ERF102-GFP bis ERF105-GFP Fusionsproteine waren im Zellkern lokalisiert. Proteininteraktionsanalysen wiesen auf die Bildung von Homo- und Heterodimeren sowie die Interaktion aller vier ERF-Proteine mit der MITOGEN-AKTIVIERTEN PROTEIN KINASE6 (MPK6) hin. Um die biologischen Funktionen von ERF102 bis ERF105 zu untersuchen, wurden Loss-of-function- und Gain-of- function-Mutanten hinsichtlich ihres Phänotyps unter normalen Wachstumsbedingungen analysiert. Der Verlust der Funktion einzelner ERF-Gene führte zu einem leicht reduzierten Pflanzenwachstum, während die Überexpression der ERF-Gene unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors zu einem leicht verstärkten Wachstum führte. Die Analyse des Wachstumsphänotyps von Doppelmutanten zeigte im Vergleich zu den jeweiligen Einzelmutanten keine additive phänotypische Wirkung. Die Ergebnisse aus den Analysen der Aminosäuresequenzen, der transkriptionellen Regulation, der gewebespezifischen Expressionsmuster, der Proteininteraktionen, der Wachstumsphänotypen sowie Ergebnisse von anderen veröffentlichten Studien deuten auf pleiotrope und damit zum Teil gleiche Funktionen von ERF102 bis ERF105 in der Pflanzenentwicklung und der Stressantwort hin. Der zweite Teil dieser Studie beschäftigte sich mit der detaillierteren funktionellen Charakterisierung von ERF105, das eine besonders relevante Rolle bei der Kältestressreaktion spielt. Expressionsanalysen zeigten, dass ERF105 schnell und transient durch Kälte hochreguliert wurde. Die Loss-of-function-Mutante von ERF105 zeigte in Elektrolytverlustmessungen und Pflanzenüberlebenstests eine reduzierte Kältetoleranz, während Gain-of-function-Mutanten (Überexpressionsmutanten) eine verbesserte Kältetoleranz aufwiesen. In Übereinstimmung mit dem Kältephänotyp zeigten sowohl nicht-akklimatisierte erf105-Mutanten als auch erf105-Mutanten nach einer Kälteakklimatisierung bei 4 °C eine verminderte Expression zahlreicher kälteregulierter Gene, wie beispielsweise CBF1, CBF2 und CBF3 sowie mehrere COR-Gene. Basierend auf den untersuchten Genexpressionsdaten und der Proteininteraktionsanalyse mit MPK6 wird daher zur Diskussion gestellt, ERF105 in den CBF-Kälte-Signaltransduktionsweg zu integrieren. Es wird vorgeschlagen, ERF105 downstream von MPK6 zu positionieren. ERF105 agiert vermutlich unabhängig von ICE1 und reguliert die CBF- und COR-Gene möglicherweise direkt und/oder indirekt durch Repression von ZAT12. Die erhöhte Kälteempfindlichkeit von erf105 korrelierte jedoch nicht mit den bei Kälte akkumulierenden Konzentrationen von löslichen Zuckern, Prolin oder ABA, welche beispielsweise als Osmo-Schutzmittel oder als Signalmoleküle zur Regulierung der Genexpression fungieren. Allerdings konnte eine erhöhte ROS-Akkumulation in erf105 sowohl vor als auch nach Kälteakklimatisierung bei 4 °C nachgewiesen werden. Flavonoide akkumulieren ebenfalls bei Kälte und tragen zu einer erhöhten Resistenz gegenüber kühlen Temperaturen unter 10 °C, aber auch Temperaturen unter 0 °C bei, indem sie beispielsweise als Antioxidantien oder Membranstabilisatoren fungieren. Die ersten enzymatischen Schritte der Flavonoidbiosynthese werden durch die für Transkriptionsfaktoren kodierende Gene MYB11, MYB12 und MYB111 kontrolliert und aktiviert. ERF105 trägt vermutlich zur Initiierung der Flavonoidbiosynthese bei, indem es die Transkriptionsfaktorgene MYB11, MYB12 und MYB111 positiv reguliert. Darüber hinaus wurde ERF105 in dieser Arbeit auch als positiver Regulator in der Reaktion auf Trockenstress, osmotischen Stress, Salz- und oxidativen Stress identifiziert. Die genaue molekulare Funktion von ERF105 in der Reaktion auf diese Stressarten muss jedoch noch näher analysiert werden.