dc.contributor.author
Seeberg, Lucas
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:10:38Z
dc.date.available
2010-07-06T07:33:17.822Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10149
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14347
dc.description.abstract
Die Verbindung zwischen der Notwendigkeit von Anästhesien bei Früh- und
Neugeborenen und dem in neonatalen Tierexperimenten festgestellten
neurodegenerativen Potential einzelner Anästhetika bietet Anlass zur
eingehenden Untersuchung der ursächlichen Zusammenhänge. Auch wenn Propofol
und Sevofluran aus klinischer Sicht als sichere Medikamente eingeschätzt
werden, so ist der Erkenntnisprozess bezüglich neurodegenerativer Effekte von
Anästhetika noch nicht abgeschlossen. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die
Untersuchung Propofol- und Sevofluran-bedingter Effekte auf primäre embryonale
Neuronenkulturen der Ratte hinsichtlich eines möglichen Einflusses auf die
Zellviabilität. Des Weiteren sollte der Einfluss von γ-Aminobuttersäure
(GABA)-Antagonisten auf diese Effekte überprüft und eine potentielle
Anästhetika-bedingte Zellschädigung mithilfe eines enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) zum Nachweis der Fragmentierung der Desoxyribonukleinsäure (DNA)
sowie durch Inhibitoren der apoptotischen / antiapototischen
Signaltransduktion spezifiziert werden. Am 18. Embryonaltag (E18) wurden
primäre kortikale Neuronen aus Wistar-Ratten gewonnen und kultiviert. Zur
Testung möglicher Substanzeffekte wurden die Zellen einer Exposition mit
Propofol in den Konzentrationen 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml und 1 mg/ml bzw. über
eine Modular Incubator Chamber mit Sevofluran in den Konzentrationen 4
Volumen-Prozent (Vol%) und 8 Vol% für 3, 6, 9, 12, 24, 48 Stunden ausgesetzt.
Die Zellviabilität wurde mithilfe des methyl thiazol tetrazolium (MTT) Tests
bestimmt und mit Werten der Kontrollgruppe verglichen. Die anschließenden
Versuchsreihen wurden unter Verwendung von Propofol und Sevofluran in den
Konzentrationen 1 mg/ml bzw. 8 Vol% durchgeführt. Um im Rahmen der
Wirkungsentfaltung der Anästhetika eine mögliche Rolle von GABA-Rezeptoren zu
evaluieren, wurden unbehandelte Neuronen mit den GABA-Rezeptor-Antagonisten
Gabazine und Picrotoxin prä- und anschließend mit dem jeweils zu
untersuchenden Anästhetikum koinkubiert. Die mit der MTT-Methode ermittelte
Zelllebensfähigkeit wurde mit der von Zellen nach alleiniger Anästhetika-
Exposition verglichen. Mittels eines ELISAs wurde eine Anästhetika-bedingte
Fragmentierung der neuronalen DNA überprüft und zwischen einem apoptotischen
und nekrotischen Degenerationsvorgang unterschieden. Die Untersuchung des
vorherrschenden Signaltransduktionsweges erfolgte unter Prä- und Koinkubation
mit dem jeweiligen Anästhetikum und spezifischen Inhibitoren der Caspasen
(zVAD-FMK), der mitogenaktivierten Protein-Kinase-Kinasen (MEK1/2) sowie der
Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) in den Konzentrationen 0,4 mM (zVAD-FMK) und
0,1 mM (MEK1/2 und PI3K). Eine Konzentration von 0,1 mg/ml Propofol zeigte ab
48 Stunden einen signifikanten Rückgang der Viabilitätswerte. Bei der höchsten
Propofolkonzentration von 1 mg/ml war eine signifikante Steigerung der
Überlebensrate neuronaler Zellen nach drei und sechs Stunden Expositionsdauer
nachzuweisen, wohingegen die ermittelten Viabilitätswerte ab 12 Stunden
Propofolexposition signifikant erniedrigt waren. Bei der Inkubation mit
Sevofluran in der Konzentration von 4 Vol% zeigte sich ein signifikanter
Abfall der Zellviabilitätswerte nach 12 Stunden, der bei 8 Vol% Sevofluran
bereits ab 6 Stunden eintrat. Unter Verwendung der GABA-Rezeptor-Antagonisten
zeigte sich eine Aufhebung der Propofol-bedingten neuroprotektiven Wirkung,
während die sowohl durch Propofol als auch durch Sevofluran ausgelöste
Neurodegeneration nicht beeinflusst wurde. Die Evaluation der Art des
vorherrschenden Degenerationsvorganges unter Anwendung eines DNA-
Fragmentierungs-ELISAs ließ auf eine signifikante Propofol-bedingte Erhöhung
der Apoptose- und Nekroserate sowie eine nur tendenziell erkennbare
Nekrosesteigerung durch Sevofluran schließen, wohingegen bei den verwendeten
Caspase- und Proteinkinase-Inhibitoren keine signifikante
Zellviabilitätsänderung nachgewiesen werden konnte. Somit konnten in der
vorliegenden Arbeit konzentrations- und expositionszeitabhängige Effekte der
beiden untersuchten Anästhetika Propofol und Sevofluran auf das sich
entwickelnde Gehirn bei Ratten nachgewiesen werden. Aufgrund der gewonnenen
Erkenntnisse und der breiten Verwendung dieser Anästhetika in der
pädiatrischen Anästhesiologie sind weitere Untersuchungen zur Spezifizierung
neurodegenerativer Effekte erforderlich, um durch eine Erweiterung des
Verständnisses der Wirkmechanismen die Entwicklung maximal sicherer
anästhesiologischer Behandlungsprotokolle gewährleisten zu können.
de
dc.description.abstract
The requirement of general anesthesia for newborns and infants going through
diagnostic or surgical interventions is undeniable. The increasing complexity
in the combination of sedative, anxiolytic and analgetic drugs used in this
regard is still contradictory to the current state of research. The aim of the
study was to evaluate the influence of propofol and sevoflurane on primary
neuronal cultures of embryonic rats. Therefore, primary cortical neuronal
cultures were prepared from Wistar rat embryos (E18), kept in 100μl Gibco
Neurobasal-A medium and exposed to 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml and 1 mg/ml propofol
respectively 4 Vol% and 8 Vol% sevoflurane for up to 48 hours. Cell viability
was assessed using the methyltetrazolium assay and was related to untreated
controls. To evaluate the role of GABAA-receptors untreated cells were
preincubated with the GABAA-receptor antagonists (GABAA-RA) gabazine or
picrotoxin, following they were exposed to 1 mg/ml propofol respectively 8
Vol% sevoflurane and the GABAA-RA. Cell viability was related to propofol
respectively sevoflurane treated controls. In addition the predominant way of
cell death was evaluated by using a DNA fragmentation ELISA. A propofol
concentration of 0.1 mg/ml reduced cell viability until 48 hours, whereas this
could already be seen as from 12 hours at a concentration of 1 mg/ml. After
three and six hours (1mg/ml) cell viability was significantly higher. Up to 6
(8 Vol.%) and 12 hours (4 Vol.%) of exposure to sevoflurane cell viability was
equal when compared with untreated controls. Only longer exposure times led to
significantly lowered cell viability. After 12 hours of exposure no
significant differences in cell viability were found between these two series.
GABAA-RA did not influence neurodegenerative effects of both anaesthetics but
abolished the potential neuroprotective effect of propofol. The cell death
detection ELISA revealed a significant higher apoptotic and necrotic fraction
of the propofol treated cells. These results confirm on the one hand that high
doses of propofol can cause potential GABAA-receptor-triggered neuroprotection
and a following time-dependent, but GABAA-independent apoptotic and necrotic
neurodegeneration in primary cortical neurons of the rat and on the other hand
that sevoflurane does not cause neurodegeneration in primary cortical neurons
of the rat following clinically relevant exposure times and concentrations.
Even though this study is limited as an in vitro model with neuronal cells, it
could demonstrate for the first time a combination of a time-dependant
neuroprotection (propofol) and -degeneration (propofol respectively
sevoflurane) when the invastigated anaesthetics were applied to primary
embryonic cultures. Further investigations should be done to identify the
underlying mechanism of neuronal damage and so to determine to what extent
established anesthetic procedures may pose significant risk to the developing
human brain.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Untersuchungen zur Wirkung von Propofol und Sevofluran auf embryonale
neuronale Zellkulturen der Ratte
dc.contributor.firstReferee
Priv.-Doz. Dr. med. T. Kerner
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. R. Kuhlen
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. med. P. Bittigau
dc.date.accepted
2010-09-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000017914-3
dc.title.translated
Evaluation of the effect of propofol and sevoflurane on primary neuronal
cultures of embryonic rats
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000017914
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000007747
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access