Two-Hybrid Studien mit N- und C-terminal verkürztem Pex13p zeigten, dass bereits die ersten 55 Aminosäuren von Pex13p eine Interaktion mit dem PTS2-Erkennungsrezeptor Pex7p eingehen. Diese Interaktion konnte in vivo durch eine Co-Immunopräzipitation gezeigt werden. Dass es sich hierbei um eine direkte Interaktion handelt, wurde in einer in vitro Bindungsstudie durch die Bindung zwischen GST-Pex13p1-100 und His6-Pex7p belegt.
Pex13p1-100 war in der Lage, sowohl mit Pex18p als auch mit Pex21p zu interagieren. Die Interaktion war hierbei von der Anwesenheit von Pex7p abhängig, wie in einer Two-Hybrid Studie gezeigt werden konnte.
Ein aminoterminal deletiertes Pex13p-Konstrukt (Pex13p56-386) war nicht in der Lage, eine pex13D Mutante zu komplementieren. Somit hat dieser aminoterminale Bereich für die Biogenese des Organells eine entscheidene Funktion inne. Es konnte weiterhin durch Fluoreszenzstudien gezeigt werden, dass dieser Bereich spezifisch für den PTS2-abhängigen Import benötigt wird. Da die PTS1-Signalerkennung über die SH3-Domäne von Pex13p erfolgt, sind zwei unterschiedliche Regionen in Pex13p an der PTS-Rezeptor-Erkennung beteiligt.
ß-Keto-Acyl-CoA-Thiolase (Fox3p) interagierte mit dem peroxisomalen Dockingprotein Pex14p, jedoch nur in Anwesenheit von Pex18p, Pex21p und von Pex7p. Andererseits konnte eine Bindung an Pex13p nicht gezeigt werden, was bedeuten könnte, dass Pex14p beim Import von PTS2-haltigen Proteinen das initiale Dockingprotein darstellt. Das Andocken der PTS2-Cargoproteine erfolgte dabei offensichtlich sowohl in Abhängigkeit von Pex7p als auch von Pex18p/Pex21p.
Die Menge an mit Pex7p co-immunopräzipitiertem Fox3p war in einer pex18Dpex21D sowie in einer pex14Dpex18Dpex21D Mutante deutlich geringer als in einer pex14D Mutante. Daraus wurde geschlossen, dass die Anwesenheit von Pex18p und Pex21p bereits vor dem Andocken von Pex7p an die peroxisomale Membran gebraucht wird. Die Funktion der beiden cytosolisch lokalisierten, redundanten Proteine Pex18p und Pex21p liegt wahrscheinlich in der Bildung eines importkompetenten PTS2-Substrat-Komplexes.
In einer in vitro Bindungsstudie mit heterolog exprimiertem His6-Pex14p und MBP-Pex7p konnte gezeigt werden, dass die Bindung zwischen Pex7p und Pex14p unabhängig von der Anwesenheit von Pex18p/Pex21p stattfinden kann und somit direkt ist.
Durch eine in vitro Bindungsstudie mit einem synthetischen PTS2-Protein gelang es zu zeigen, dass Pex7p direkt an das PTS2-Signal binden kann.
Mit der Methode des Two-Hybrid Systems konnte in Pex13p eine zweite Bindestelle für Pex14p identifiziert werden. Der Bindebereich umfasst die Aminosäuren 233-258 von Pex13p. Im Gegensatz zur SH3-Domäne erfolgt diese Bindung unabhängig von dem prolinreichen Motiv von Pex14p.
Durch heterologe Expression von Pex19p und seine Verwendung als Antigen konnte ein Antiserum gegen das Protein gewonnen und dessen Spezifität gezeigt werden.
In einer Two-Hybrid Studie konnte die Interaktion zwischen Pex19p und Pex13p gezeigt werden. Der Aminosäurebereich 173-258 von Pex13p war ausreichend, um die Bindung in vivo zu vermitteln. Mit einem Peptidscan gelang es außerdem, den notwendigen Bindebereich für Pex19p auf die Aminosäuren 203-213 von Pex13p einzuengen.
Auf der Suche nach einem möglichen allgemeinen Targetingsignal für Membranproteine wurde der über einen Peptidscan ermittelte Pex19p-Bindebereich 203-IMKFLKKILYR-213 umfassend substituiert. Die beiden Leucine in Position 207 und 211 erwiesen sich hierbei als entscheidend, womit sie vermutlich eine besondere Rolle bei der Bindung an Pex19p einnehmen.
Es wurde ein Modell erstellt, welches den möglichen Ablauf des PTS2-abhängigen Proteinimports bechreibt (Abb. 4.1).
Two Hybrid studies with N-and C-terminal deletions of Pex13p showed that the first 55 amino acids of Pex13p are sufficient to bind the PTS2-recognition protein Pex7p. This binding between Pex13p and Pex7p could also be demonstrated through a co-immunoprecipitation. An in vivo binding study proved direct binding between the first 100 amino acids of Pex13p and His6-Pex7p.
Pex13p1-100 could also interact with Pex18p and Pex21p, though this interaction was shown to depend on the presence of Pex7p by two-hybrid studies.
The aminoterminal truncation of Pex13p56-386 is unable to complement the growth defect of a pex13D mutant. As a consequence, this aminoterminal region possesses an essential function for the biogenesis of the peroxisome. Immunofluorescence studies demonstrated further, that this region is particularly necessary for PTS2-dependent protein import. As PTS1-signal recognition [Elgersma, 1996 #192; Erdmann, 1996 #24; Gould, 1996 #239] depends on the SH3-domain of Pex13p, two different regions of Pex13p are obviously involved in PTS-receptor recognition.
b?Keto-acyl-CoA-thiolase (Fox3p) is able to interact with Pex14p in a wild- type strain, though not in a pex7D or in a pex18Dpex21D mutant strain. On the other hand, binding could not be observed between Fox3p and Pex13p, suggesting that Pex14p represents the initial docking protein. Docking of PTS2 cargo proteins is obviously dependent on both Pex18p/Pex21p and Pex7p.
The amount of Fox3p coprecipitated with Pex7p in a pex18Dpex21D and in a pex14Dpex18Dpex21D mutant strain was significantly smaller than in a pex14D mutant strain. Therefore it was concluded that the presence of Pex18p and Pex21p is required previously to the docking of Pex7p to the peroxisomal membrane. The two redundant cytosolic proteins Pex18p and Pex21p seem to play an essential role in the formation of an import competent PTS2 substrate complex.
The ability of Pex7p for binding to Pex14p was analyzed by in vitro binding with bacterially expressed MBP-Pex7p and His6-Pex14p in the absence of Pex18p/Pex21p. The binding between these proteins thus occurs in a direct manner.
Pex7p binds a synthetic PTS2-Protein in vitro, implicating that Pex7p alone is sufficient to recognize the PTS2 targeting signal.
A second binding site for Pex14p could be identified in Pex13p using the yeast two-hybrid system. This second binding site comprises amino acids 223-258 of Pex13p. In contrast to the SH3-domain, this binding does not depend on the prolin-rich motif of Pex14p.
A polyclonal antibody against Pex19p could be generated from heterologously expressed and purified GST-Pex19p. Its specificity could be demonstrated.
The binding between Pex19p and Pex13p could be shown in a two-hybrid assay. A truncated version of Pex13p, representing the amino acids 173-258, was shown to be sufficient for Pex19p binding in vivo. The incubation of a Pex13p peptide-scan with GST-Pex19p could narrow this binding region for Pex19p down to amino acids 203?213 of Pex13p.
Searching for a probably common membrane-protein targeting signal, a Pex13p peptide, comprising the sequence 203-IMKFLKKILYR-213, was analyzed by substitutions. This studies elucidated that the leucine residues in position 207 and 211 seem to be particulary important for the ability for binding by Pex19p.
A revised model for the PTS2-dependent import of matrix proteins and its sequential steps was developed (Abb. 4.1).
