Protein kinase C epsilon (PKCɛ) is an intracellular signaling protein activated in conditions associated with strong cellular stress such as ischemia, cancer, and inflammation. PKCɛ is activated within seconds and mediates rapid short-term effects but also effects lasting for hours and weeks. How acute activation transforms to long-lasting effects cannot be explained on the basis of the currently known PKCɛ substrates. In a PKCɛ substrate candidate screen, we identified several new PKCɛ substrates, which are known to be involved in protein translation, a process PKCɛ has so far not been associated with. The modulation of translation may represent a mechanism underlying the transition from acute to long-lasting effects. Thus, the aim of this work was to investigate if PKCɛ has a yet unrecognized role in stress responses and protein translation. I focused on the role of PKCɛ in two subcellular structures, stress granules and P-bodies. Both cytoplasmic structures are vital for the modulation of protein translation in response to stress. I found that PKCɛ and its adaptor proteins RACK1 and RACK2 are recruited to stress granules and P-bodies in F-11, HeLa, and HEK293T cells. To investigate the function of PKCɛ for the formation of these RNA granules, I performed siRNA knockdown studies and blocked the activity of PKCɛ with pharmacological inhibitors. For data acquisition an automated “High Content Screening” microscopy approach was established, which allowed the quantification of granule formation at the single cell level. PKCɛ down- regulation as well as inhibition increased the number of stress granules. PKCɛ down-regulation also induced P-body formation, but acute PKC inhibition did not alter P-body formation. The increase of RNA-granules suggests a decrease of free and translatable mRNAs. Accordingly, I found decreased protein translation upon PKCɛ knockdown using a fluorescence-based method to visualize newly translated proteins (FUNCAT). Furthermore, I found evidence that the recruitment of signaling molecules to translation modifying granules appears to be a more general phenomenon. In addition to PKCɛ, a member of the family of “novel PKCs”, I found classical PKCs to be involved in granule formation as well. In addition to PKCs, I also observed the RII alpha subunit of protein kinase A (PKA) to be recruited to stress granules and P-bodies in response to cell stress. Thus, my data reveal a novel function of PKCɛ for the formation of RNA granules, which results in altered protein translation. My data therefore open the way to investigate, to what extend PKCɛ and PKA recruitment to cytoplasmic RNA granules serves a similar function for stress responses, as well as to what extend translation regulation can explain the transition from acute activation to long-lasting effects.
Die Proteinkinase C epsilon (PKCɛ) ist ein intrazelluläres Signalprotein, welches unter starkem zellulärem Stress wie z.B. Ischemie, Krebs oder auch bei Entzündungsprozessen aktiviert wird. Die Aktivierung von PKCɛ geschieht innerhalb weniger Sekunden und vermittelt neben kurzfristigen Effekten auch Effekte, die Stunden oder gar Wochen anhalten. Wie genau es zu dem Übergang von akuter Aktivierung zu langanhaltenden Effekten kommt, lässt sich basierend auf den bisher bekannten PKCɛ-Substraten nicht erklären. In einer groß angelegten Untersuchung zur Identifizierung von PKCɛ-Substratkandidaten, die in unserem Labor durchgeführt wurde, fanden wir einen großen Anteil an Proteinen, die in die Proteintranslation involviert sind. Jedoch wurde PKCɛ im Prozess der Proteintranslation bisher nicht beschrieben. Die Modulierung der Proteinexpression könnte ein Mechanismus sein, der den Übergang von akuten zu lang anhaltenden Effekten erklärt. Daher war das Ziel dieser Arbeit, zu untersuchen, ob PKCɛ eine bisher unerkannte Funktion innerhalb der Stressantwort und der Proteintranslation erfüllt. Ich konzentrierte mich auf die Rolle der PKCɛ in zwei subzellulären Strukturen, den sogenannten Stress granules und P-bodies. Beide zytoplasmatische Strukturen sind wesentlich an der Modulierung der Proteintranslation als Stressantwort beteiligt. Ich fand heraus, dass in F-11-, HeLa- und HEK293T-Zellen sowohl PKCɛ als auch ihre Adapterproteine RACK1 und RACK2 zu Stress granules und P-bodies rekrutiert werden. Um die Funktion der PKCɛ in diesen RNA-Strukturen zu untersuchen, reduzierte ich die zelluläre Verfügbarkeit der PKCɛ mittels siRNA basierter Herunterregulierung oder pharmakologischer Inhibierung. Zur Datengewinnung wurde ein automatisches „High Content Screening“-Mikroskopie-Konzept etabliert, das die Quantifizierung der granules auf Einzelzellniveau ermöglichte. Sowohl die Herunterregulierung der PKCɛ, als auch ihre Inhibierung erhöhte die Zahl der Stress granules. PKCɛ-Herunterregulierung erhöhte ebenfalls die Zahl der P-bodies, jedoch beeinflusste zumindest die akute PKC-Aktivierung die Bildung der P-bodies nicht. Die Erhöhung der RNA- granules suggeriert einen Abfall freier und translatierbarer mRNA. Dementsprechend fand ich, mit Hilfe der Durchführung einer fluoreszenzbasierten Methode zur Visualisierung neu translatierter Proteine (FUNCAT), eine Abnahme neu synthetisierter Proteine nach PKCɛ- Herunterregulierung. Des Weiteren fand ich Belege dafür, dass die Rekrutierung zu translationsmodifizierenden granules ein generelles Phänomen zu sein scheint. Ich konnte zeigen, dass neben PKCɛ, einem Mitglied der „neuen“ Proteinkinase C-Familie, auch klassische PKCs bei der Entstehung der granules eine Rolle spielen. Über PKCs hinausgehend fand ich, dass auch die RII alpha Untereinheit der Proteinkinase A (PKA) in Folge von Stress in Stress granules und P-bodies lokalisiert ist. Somit decken meine Daten eine neue Funktion der PKCε innerhalb der Bildung von RNAgranules auf, die in einer veränderten Proteintranslation resultieren. Meine Daten eröffnen damit die Möglichkeit zu untersuchen, in welchem Maß die Rekrutierung von PKCε und PKA zu zytoplasmatischen RNA granules ähnliche Funktionen innerhalb der Stressantworten ausführt und in welchem Maß Translationsregulation den Übergang von akuter Aktivierung zu langanhaltenden Effekten zu erklären vermag.
