dc.contributor.author
Ibrahim, Mohammad Abdelwahab Ali
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:09:53Z
dc.date.available
2018-05-14T10:38:40.490Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10123
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14321
dc.description.abstract
Nearly half of dairy cows develop uterine diseases in the first weeks after
parturition, the most common manifestation being endometritis. Such diseases
profoundly affect reproductive performance and reduce the profit potential of
dairy farms, with an associated yearly cost of €1.4 billion within the
European Union. Bacteria that enter into the uterus after calving trigger an
innate immune response that results in the release of cytokines and
antimicrobial peptides (AMP). There are different classes of AMP, which exert
their antimicrobial action through different mechanisms. The beta-defensin
(DEFB) family consists of cationic AMP that can permeabilize bacterial
membranes. This family includes DEFB1, DEFB4A, and DEFB5, lingual AMP (LAP),
and tracheal AMP (TAP). The bactericidal/permeability-increasing protein is
also a cationic AMP that bind to bacterial lipopolysaccharides (LPS) that
eventually results in the death of bacteria. Another AMP family is the S100
calcium-binding protein (S100A) family including the following members:
S100A8, S100A9, S100A11, and S100A12. These AMP exert their antimicrobial
action through chelation of several ions. The host immune response and release
of AMP is essential for the removal of invading bacteria. A variety of
bacterial strains have been discovered in the uterus so far. These include
Escherichia coli and Trueperella pyogenes, which are the most important
bacterial species associated with endometritis. The aim of this research
project was to better understand the innate immune response in the context of
postpartum uterine diseases. In the current project, the mRNA expression
pattern of selected AMP (DEFB1, DEFB4A, DEFB5, LAP, TAP, BPI, S100A8, S100A9,
S100A11, and S100A12) was evaluated in bovine endometrial cells collected (1)
at different stages of the oestrous cycle; (2) during the puerperium depending
on uterine health status (healthy, subclinical, or clinical endometritis)
starting on Day 24 to 30 postpartum for 3 weeks on a weekly basis; and (3) in
cell cultures in presence of Bacillus pumilus at three different
multiplicities of infection (MOI 1, 5, and 10) up to 6 hours. Furthermore, to
gain insights into bacterial factors contributing to the host-pathogen
interactions, two strains of T. pyogenes were included in this study: one
strain (TP2) was isolated from the uterus of a postpartum dairy cow developing
CE and a second strain (TP5) was isolated from a uterus of a healthy cow. The
two strains were compared in terms of their metabolic fingerprints, growth
rate, virulence gene transcription, and effect on bovine endometrial
epithelial cells in vitro. Finally, the effect of the presence of immune cells
on the response of endometrial cells to T. pyogenes was evaluated. The
endometrium samples were either collected at the abattoir (oestrous cycle) or
from postpartum cows on a dairy farm using the cytobrush technique. For in
vitro experiments, endometrial epithelial cells isolated from different
animals were co-cultured with live B. pumilus at MOI of 1, 5, and 10, or T.
pyogenes (TP2 or TP5) in form of live, heat-inactivated (HI) or bacteria-free
filtrate (BFF) at a MOI of 1, or live TP2 and/or PBMC at a ratio of 1:1 to
epithelial cells. Total RNA was isolated from endometrial cells and subjected
to a reverse transcription-polymerase chain reaction for quantification of the
mRNA expression of selected AMP or pro-inflammatory mediators. The results
showed that the mRNA expression of all candidate AMP, except DEFB1, S100A8,
and S100A9, was oestrous cycle-dependent. Higher mRNA expression was observed
around ovulation compared with luteal phases. The mRNA expression of almost
all candidate AMP was uterine health status-dependent, with higher mRNA
expression in inflamed than in healthy endometrium, especially during the late
stage of the puerperium (week 5–7). In cell culture experiments, the presence
of B. pumilus had no significant effect on mRNA expression of the DEFB family
but higher mRNA expression of S100A8 and S100A9 was observed in the presence
of B. pumilus. TP2 grew at a faster rate, expressed more virulence factors
such as collagen-binding protein (cbpA), neuraminidase H cell wall-bound
protein (nanH), and fimbrial protein subunit E and G (fimE and fimG), and
elicited a higher mRNA expression of pro-inflammatory factors such as
prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), chemokines (C-X-C motif)
ligands 3 (CXCL3), and interleukin (IL) 8 in bovine endometrial epithelial
cells compared with TP5. The presence of PBMC amplified the mRNA expression of
pro-inflammatory factors (PTGS2, CXCL3, IL1A, IL6, and IL8) in bovine
endometrial epithelial cells co-cultured with live TP2 compared with untreated
cells, especially as early as after 4 h. In summary, it can be assumed that
AMP are important components of the innate immune system in the uterus that
create an environment that is free of pathogenic bacteria. Higher mRNA
expression of the candidate AMP around ovulation or in inflamed endometrium
during the puerperium suggests their crucial role in uterine innate immunity
to defend against invading pathogenic bacteria. TP2 has distinct differences
in the mRNA expression of certain virulence factors, a distinct metabolic
profile, and different growth characteristics compared with TP5. Therefore,
the strain of T. pyogenes could be a crucial factor for the development of
endometritis in dairy cows after parturition. Moreover, the pro-inflammatory
response of endometrial cells was amplified in the presence of immune cells.
Therefore, communication between endometrial cells and immune cells might be
important for bacterial clearance.
de
dc.description.abstract
Annähernd die Hälfte der Milchkühe entwickelt Krankheiten des Uterus in den
ersten Wochen nach der Abkalbung. Die häufigste Uteruserkrankung postpartum
ist die Endometritis. Solche Erkrankungen beeinflussen nachhaltig die
Fruchtbarkeit und reduzieren den Gewinn von Milchkuhbetrieben in der
Europäischen Union um jährlich 1,4 Milliarden Euro. Bakterien, die nach der
Kalbung in den Uterus aufsteigen, bewirken eine Antwort des angeborenen
Immunsystems, was zur Freisetzung von Cytokinen und antimikrobiellen Peptiden
(AMP) führt. Es gibt verschiedene Klassen von AMP, welche ihre antimikrobielle
Wirkung durch unterschiedliche Mechanismen erzielen. Die beta-Defensin
(DEFB)-Familie besteht aus kationischen AMP, die bakterielle Membranen
permeabilisieren können. Diese Familie beinhaltet DEFB1, DEFB4A, DEFB5,
linguales AMP (LAP) und tracheales AMP (TAP). Das „bactericidal/permeability
increasing protein“ (BPI) ist auch ein kationisches AMP, das an bakterielles
Lipopolysaccharid (LPS) bindet und dadurch den Tod von Bakterien erwirken
kann. Eine andere AMP-Familie ist die S100-Calcium-bindende Protein-Familie
(S100A), welche die folgenden Mitglieder enthält: S100A8, S100A9, S1100A11 und
S100A12. Diese AMP entfalten ihre antimikrobielle Wirkung durch Chelatierung
von verschiedenen Ionen. Die Immunantwort des Wirtsorganismus und die
Freisetzung von AMP sind grundlegend für die Entfernung der eingewanderten
Bakterien. Bisher wurde eine Vielzahl von Bakterienstämmen im Uterus entdeckt.
Diese beinhalten Escherichia coli und Trueperella pyogenes, welche die
wichtigsten Bakterienstämme sind, die mit Endometritis assoziiert sind. Das
Ziel dieses Forschungsprojekts war, die angeborene Immunantwort im Rahmen von
postpartalen Uteruserkrankungen besser verstehen zu können. In dem aktuellen
Projekt wurden das mRNA-Expressionsmuster ausgewählter AMP (DEFB1, DEFB4A,
DEFB5, LAP, TAP, BPI, S100A8, S100A9, S100A11 und S100A12) in bovinen
Endometriumszellen untersucht. Die Endometriumszellen wurden gewonnen (1)
während verschiedener Stadien des Sexualzykluses, (2) während des Puerperiums
in Abhängigkeit vom Gesundheitsstatus des Uterus (gesund, subklinische oder
klinische Endometritis) ab Tag 24-30 postpartum in einem wöchentlichen
Rhythmus für die folgenden drei Wochen; und (3) in Zellkulturen in Anwesenheit
von Bacillus pumilis in drei verschiedenen Gehalten (Muliplicities of
infection (MOI) von 1, 5 und 10). Des Weiteren wurden zwei T. pyogenes Stämmen
in diese Studie aufgenommen, um zu untersuchen, wie bakterielle Faktoren zu
Wirts-Pathogen-Interaktionen beitragen. Ein Stamm (TP2) wurde aus dem Uterus
einer Kuh postpartum gewonnen, die an klinischer Endometritis erkrankte und
der zweite Stamm (TP5) wurde aus einem gesunden Uterus isoliert. Diese beiden
Stämme wurden verglichen in Bezug auf ihre metabolischen „Fingerabdrücke“,
Wachstumsraten, Transkription von Virulenzgenen und ihren Einfluss auf
endometriale Epithelzellkulturen in vitro. Ebenso wurde der Effekt der
Anwesenheit von Immunzellen auf endometriale Epithelzellen in vitro
untersucht. Endometriumsproben wurden entweder am Schlachthof (Sexualzyklus)
oder im Milchviehbetrieb mittels Cytobrush-Technik gewonnen. Für die in vitro-
Experimente wurden endometriale Epithelzellen aus verschiedenen Tieren
isoliert und mit lebenden B. pumilus in einer MOI von 1, 5 und 10 oder mit T.
pyogenes (TP2 und TP5) in Form von lebenden, hitze-inaktivierten (HI) oder
bakterien-freien Filtraten (BFF) in einer MOI von 1 inkubiert. Ebenso wurden
Epithelzellen und/oder mit PBMC in einem Verhältnis von 1:1 mit lebenden TP2
ko-kultiviert. Gesamt-RNA wurde aus Endometriumszellen isoliert und mittels
reverser Transkriptions-Polymerase Kettenreaktion wurde die Quantifizierung
der mRNA-Expression ausgewählten AMP oder pro-inflammatorischen Mediatoren
durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die mRNA-Expression aller
Kandidaten-AMP, außer DEFB1, S100A8 und S100A9, abhängig vom Sexualzyklus
beeinflusst war. Um die Ovulation herum war im Vergleich zur Lutealphase die
mRNA-Expression höher. Die mRNA-Expression fast aller untersuchter Kandidaten-
AMP war abhängig vom Gesundheitszustand des Uterus mit erhöhter mRNA-
Expression bei entzündetem Endometrium verglichen mit einem gesundem
Endometrium, besonders im späteren Stadium des Puerperiums (Woche 5-7). In
Zellkulturversuchen hatte die Gegenwart von B. pumilus keinen signifikanten
Effekt auf die mRNA-Expression der DEFB-Familie. Aber eine höhere mRNA-
Expression von S100A8 und S100A9 konnte in Gegenwart von B. pumilus beobachtet
werden. TP2 wuchs schneller und exprimierte mehr Virulenzfaktoren [collagen-
binding protein (cbpA), neuraminidase H cell wall-bound protein (nanH), und
fimbrial protein subunit E und G (fimE und fimG)] als TP5 und rief eine höhere
mRNA-Expression von pro-inflammatorischen Faktoren [(prostaglandin-
endoperoxide synthase 2 (PTGS2), chemokines (C-X-C motif) ligands 3 (CXCL3),
interleukin (IL)-8)] in bovinen endometrialen Epithelzellen hervor verglichen
mit TP5. Außerdem war die mRNA-Expression von pro-inflammatorischen Faktoren
PTGS2, CXCL3, IL1A, IL6 und IL8 in bovinen endometrialen Epithelzellen in Ko-
Kultur mit lebenden TP2 durch die Anwesenheit von Immunzellen verstärkt,
verglichen mit unbehandelten Zellen. Dies war schon nach 4 Stunden
beobachtbar. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass AMP wichtige
Komponenten für die angeborene Immunabwehr im Uterus sind, die ein Milieu
erzeugen, welches frei von pathogenen Bakterien ist. Eine erhöhte mRNA-
Expression der Kandidaten-AMP um die Ovulation herum oder in entzündetem
Endometrium während des Puerperiums weisen auf eine entscheidende Rolle bei
der angeborenen Immunabwehr des Uterus bei der Bekämpfung der einwandernden
pathogenen Bakterien hin. TP2 zeigte deutliche Unterschiede in der mRNA-
Expression bestimmter Virulenzfaktoren, im metabolischen Profil und bei dem
Wachstum im Vergleich zu TP5. Demzufolge könnte der T. pyogenes-Stamm ein
entscheidender Faktor für die Entstehung von Endometritis bei Milchkühen nach
dem Abkalben sein. Darüber hinaus wurde die pro–inflammatorische Antwort der
Endometriumszellen in Anwesenheit von Immunzellen amplifiziert. Aus diesem
Grund könnte die Kommunikation zwischen Endometriumszellen und Immunzellen
wichtig für die Beseitigung von Bakterien sein.
de
dc.format.extent
IV, 104 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
immune response
dc.subject
gene expression
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Studies of the development of endometritis in cattle on a cellular basis
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Christoph Gabler
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Dr. Ralf Einspanier
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Johannes Handler
dc.date.accepted
2017-12-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000107103-1
dc.title.translated
Untersuchungen auf zellulärer Ebene zur Entstehung von Endometritis in Kühen
de
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
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FUDISS_thesis_000000107103
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Mensch und Buch Verlag
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