Nearly half of dairy cows develop uterine diseases in the first weeks after parturition, the most common manifestation being endometritis. Such diseases profoundly affect reproductive performance and reduce the profit potential of dairy farms, with an associated yearly cost of €1.4 billion within the European Union. Bacteria that enter into the uterus after calving trigger an innate immune response that results in the release of cytokines and antimicrobial peptides (AMP). There are different classes of AMP, which exert their antimicrobial action through different mechanisms. The beta-defensin (DEFB) family consists of cationic AMP that can permeabilize bacterial membranes. This family includes DEFB1, DEFB4A, and DEFB5, lingual AMP (LAP), and tracheal AMP (TAP). The bactericidal/permeability-increasing protein is also a cationic AMP that bind to bacterial lipopolysaccharides (LPS) that eventually results in the death of bacteria. Another AMP family is the S100 calcium-binding protein (S100A) family including the following members: S100A8, S100A9, S100A11, and S100A12. These AMP exert their antimicrobial action through chelation of several ions. The host immune response and release of AMP is essential for the removal of invading bacteria. A variety of bacterial strains have been discovered in the uterus so far. These include Escherichia coli and Trueperella pyogenes, which are the most important bacterial species associated with endometritis. The aim of this research project was to better understand the innate immune response in the context of postpartum uterine diseases. In the current project, the mRNA expression pattern of selected AMP (DEFB1, DEFB4A, DEFB5, LAP, TAP, BPI, S100A8, S100A9, S100A11, and S100A12) was evaluated in bovine endometrial cells collected (1) at different stages of the oestrous cycle; (2) during the puerperium depending on uterine health status (healthy, subclinical, or clinical endometritis) starting on Day 24 to 30 postpartum for 3 weeks on a weekly basis; and (3) in cell cultures in presence of Bacillus pumilus at three different multiplicities of infection (MOI 1, 5, and 10) up to 6 hours. Furthermore, to gain insights into bacterial factors contributing to the host-pathogen interactions, two strains of T. pyogenes were included in this study: one strain (TP2) was isolated from the uterus of a postpartum dairy cow developing CE and a second strain (TP5) was isolated from a uterus of a healthy cow. The two strains were compared in terms of their metabolic fingerprints, growth rate, virulence gene transcription, and effect on bovine endometrial epithelial cells in vitro. Finally, the effect of the presence of immune cells on the response of endometrial cells to T. pyogenes was evaluated. The endometrium samples were either collected at the abattoir (oestrous cycle) or from postpartum cows on a dairy farm using the cytobrush technique. For in vitro experiments, endometrial epithelial cells isolated from different animals were co-cultured with live B. pumilus at MOI of 1, 5, and 10, or T. pyogenes (TP2 or TP5) in form of live, heat-inactivated (HI) or bacteria-free filtrate (BFF) at a MOI of 1, or live TP2 and/or PBMC at a ratio of 1:1 to epithelial cells. Total RNA was isolated from endometrial cells and subjected to a reverse transcription-polymerase chain reaction for quantification of the mRNA expression of selected AMP or pro-inflammatory mediators. The results showed that the mRNA expression of all candidate AMP, except DEFB1, S100A8, and S100A9, was oestrous cycle-dependent. Higher mRNA expression was observed around ovulation compared with luteal phases. The mRNA expression of almost all candidate AMP was uterine health status-dependent, with higher mRNA expression in inflamed than in healthy endometrium, especially during the late stage of the puerperium (week 5–7). In cell culture experiments, the presence of B. pumilus had no significant effect on mRNA expression of the DEFB family but higher mRNA expression of S100A8 and S100A9 was observed in the presence of B. pumilus. TP2 grew at a faster rate, expressed more virulence factors such as collagen-binding protein (cbpA), neuraminidase H cell wall-bound protein (nanH), and fimbrial protein subunit E and G (fimE and fimG), and elicited a higher mRNA expression of pro-inflammatory factors such as prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), chemokines (C-X-C motif) ligands 3 (CXCL3), and interleukin (IL) 8 in bovine endometrial epithelial cells compared with TP5. The presence of PBMC amplified the mRNA expression of pro-inflammatory factors (PTGS2, CXCL3, IL1A, IL6, and IL8) in bovine endometrial epithelial cells co-cultured with live TP2 compared with untreated cells, especially as early as after 4 h. In summary, it can be assumed that AMP are important components of the innate immune system in the uterus that create an environment that is free of pathogenic bacteria. Higher mRNA expression of the candidate AMP around ovulation or in inflamed endometrium during the puerperium suggests their crucial role in uterine innate immunity to defend against invading pathogenic bacteria. TP2 has distinct differences in the mRNA expression of certain virulence factors, a distinct metabolic profile, and different growth characteristics compared with TP5. Therefore, the strain of T. pyogenes could be a crucial factor for the development of endometritis in dairy cows after parturition. Moreover, the pro-inflammatory response of endometrial cells was amplified in the presence of immune cells. Therefore, communication between endometrial cells and immune cells might be important for bacterial clearance.
Annähernd die Hälfte der Milchkühe entwickelt Krankheiten des Uterus in den ersten Wochen nach der Abkalbung. Die häufigste Uteruserkrankung postpartum ist die Endometritis. Solche Erkrankungen beeinflussen nachhaltig die Fruchtbarkeit und reduzieren den Gewinn von Milchkuhbetrieben in der Europäischen Union um jährlich 1,4 Milliarden Euro. Bakterien, die nach der Kalbung in den Uterus aufsteigen, bewirken eine Antwort des angeborenen Immunsystems, was zur Freisetzung von Cytokinen und antimikrobiellen Peptiden (AMP) führt. Es gibt verschiedene Klassen von AMP, welche ihre antimikrobielle Wirkung durch unterschiedliche Mechanismen erzielen. Die beta-Defensin (DEFB)-Familie besteht aus kationischen AMP, die bakterielle Membranen permeabilisieren können. Diese Familie beinhaltet DEFB1, DEFB4A, DEFB5, linguales AMP (LAP) und tracheales AMP (TAP). Das „bactericidal/permeability increasing protein“ (BPI) ist auch ein kationisches AMP, das an bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) bindet und dadurch den Tod von Bakterien erwirken kann. Eine andere AMP-Familie ist die S100-Calcium-bindende Protein-Familie (S100A), welche die folgenden Mitglieder enthält: S100A8, S100A9, S1100A11 und S100A12. Diese AMP entfalten ihre antimikrobielle Wirkung durch Chelatierung von verschiedenen Ionen. Die Immunantwort des Wirtsorganismus und die Freisetzung von AMP sind grundlegend für die Entfernung der eingewanderten Bakterien. Bisher wurde eine Vielzahl von Bakterienstämmen im Uterus entdeckt. Diese beinhalten Escherichia coli und Trueperella pyogenes, welche die wichtigsten Bakterienstämme sind, die mit Endometritis assoziiert sind. Das Ziel dieses Forschungsprojekts war, die angeborene Immunantwort im Rahmen von postpartalen Uteruserkrankungen besser verstehen zu können. In dem aktuellen Projekt wurden das mRNA-Expressionsmuster ausgewählter AMP (DEFB1, DEFB4A, DEFB5, LAP, TAP, BPI, S100A8, S100A9, S100A11 und S100A12) in bovinen Endometriumszellen untersucht. Die Endometriumszellen wurden gewonnen (1) während verschiedener Stadien des Sexualzykluses, (2) während des Puerperiums in Abhängigkeit vom Gesundheitsstatus des Uterus (gesund, subklinische oder klinische Endometritis) ab Tag 24-30 postpartum in einem wöchentlichen Rhythmus für die folgenden drei Wochen; und (3) in Zellkulturen in Anwesenheit von Bacillus pumilis in drei verschiedenen Gehalten (Muliplicities of infection (MOI) von 1, 5 und 10). Des Weiteren wurden zwei T. pyogenes Stämmen in diese Studie aufgenommen, um zu untersuchen, wie bakterielle Faktoren zu Wirts-Pathogen-Interaktionen beitragen. Ein Stamm (TP2) wurde aus dem Uterus einer Kuh postpartum gewonnen, die an klinischer Endometritis erkrankte und der zweite Stamm (TP5) wurde aus einem gesunden Uterus isoliert. Diese beiden Stämme wurden verglichen in Bezug auf ihre metabolischen „Fingerabdrücke“, Wachstumsraten, Transkription von Virulenzgenen und ihren Einfluss auf endometriale Epithelzellkulturen in vitro. Ebenso wurde der Effekt der Anwesenheit von Immunzellen auf endometriale Epithelzellen in vitro untersucht. Endometriumsproben wurden entweder am Schlachthof (Sexualzyklus) oder im Milchviehbetrieb mittels Cytobrush-Technik gewonnen. Für die in vitro- Experimente wurden endometriale Epithelzellen aus verschiedenen Tieren isoliert und mit lebenden B. pumilus in einer MOI von 1, 5 und 10 oder mit T. pyogenes (TP2 und TP5) in Form von lebenden, hitze-inaktivierten (HI) oder bakterien-freien Filtraten (BFF) in einer MOI von 1 inkubiert. Ebenso wurden Epithelzellen und/oder mit PBMC in einem Verhältnis von 1:1 mit lebenden TP2 ko-kultiviert. Gesamt-RNA wurde aus Endometriumszellen isoliert und mittels reverser Transkriptions-Polymerase Kettenreaktion wurde die Quantifizierung der mRNA-Expression ausgewählten AMP oder pro-inflammatorischen Mediatoren durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die mRNA-Expression aller Kandidaten-AMP, außer DEFB1, S100A8 und S100A9, abhängig vom Sexualzyklus beeinflusst war. Um die Ovulation herum war im Vergleich zur Lutealphase die mRNA-Expression höher. Die mRNA-Expression fast aller untersuchter Kandidaten- AMP war abhängig vom Gesundheitszustand des Uterus mit erhöhter mRNA- Expression bei entzündetem Endometrium verglichen mit einem gesundem Endometrium, besonders im späteren Stadium des Puerperiums (Woche 5-7). In Zellkulturversuchen hatte die Gegenwart von B. pumilus keinen signifikanten Effekt auf die mRNA-Expression der DEFB-Familie. Aber eine höhere mRNA- Expression von S100A8 und S100A9 konnte in Gegenwart von B. pumilus beobachtet werden. TP2 wuchs schneller und exprimierte mehr Virulenzfaktoren [collagen- binding protein (cbpA), neuraminidase H cell wall-bound protein (nanH), und fimbrial protein subunit E und G (fimE und fimG)] als TP5 und rief eine höhere mRNA-Expression von pro-inflammatorischen Faktoren [(prostaglandin- endoperoxide synthase 2 (PTGS2), chemokines (C-X-C motif) ligands 3 (CXCL3), interleukin (IL)-8)] in bovinen endometrialen Epithelzellen hervor verglichen mit TP5. Außerdem war die mRNA-Expression von pro-inflammatorischen Faktoren PTGS2, CXCL3, IL1A, IL6 und IL8 in bovinen endometrialen Epithelzellen in Ko- Kultur mit lebenden TP2 durch die Anwesenheit von Immunzellen verstärkt, verglichen mit unbehandelten Zellen. Dies war schon nach 4 Stunden beobachtbar. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass AMP wichtige Komponenten für die angeborene Immunabwehr im Uterus sind, die ein Milieu erzeugen, welches frei von pathogenen Bakterien ist. Eine erhöhte mRNA- Expression der Kandidaten-AMP um die Ovulation herum oder in entzündetem Endometrium während des Puerperiums weisen auf eine entscheidende Rolle bei der angeborenen Immunabwehr des Uterus bei der Bekämpfung der einwandernden pathogenen Bakterien hin. TP2 zeigte deutliche Unterschiede in der mRNA- Expression bestimmter Virulenzfaktoren, im metabolischen Profil und bei dem Wachstum im Vergleich zu TP5. Demzufolge könnte der T. pyogenes-Stamm ein entscheidender Faktor für die Entstehung von Endometritis bei Milchkühen nach dem Abkalben sein. Darüber hinaus wurde die pro–inflammatorische Antwort der Endometriumszellen in Anwesenheit von Immunzellen amplifiziert. Aus diesem Grund könnte die Kommunikation zwischen Endometriumszellen und Immunzellen wichtig für die Beseitigung von Bakterien sein.
