Expression of angiotensin receptors in the rat brain after focal cerebral ischemia

Abstract

The Renin-Angiotensin System (RAS) is well known for its function as a regulator of blood pressure and fluid and electrolyte balance with its major effective peptide Angiotensin II. Beside the systemic RAS, a lot of other tissues such as the heart, lungs, liver and the blood vessels have been shown to produce Ang II. The RAS was first known to act only in the periphery. Later RAS and its components were found in the brain and appeared to be autonomous. The development of selective receptor antagonists led to the discovery of the angiotensin receptors. Among these, the AT1 and AT2 receptor subtypes seem to play an important role in ischemic processes. The numerous studies of angiotensin receptors in the last two decades showed that the AT1 receptor was found to be abundant in the mature brain while the AT2 receptor was highly expressed before and during the neonatal period and its expression decreased speedily afterwards. Therefore the AT1 receptor has been studied profusely while much less was known about the AT2 receptor. The majority of the studies were done in vitro. So our aim was to show the distribution of the two receptors in vivo as well as to identify the cells of expression and possible correlations with the apoptosis and inflammation following cerebral ischemia. Using the method of transient MCAO we induced a 90 min focal cerebral ischemia in the right cerebral hemisphere of animals from the “stroke group”, while the “sham” animals underwent only a superficial skin surgery. Then performing immunohistological, fluorescent, molecular and proteinbiochemical methods we were able to show significant differences. First, we found that there was an upregulation of AT2 receptor expression in the ischemic brain hemisphere, especially in the striatum, cerebral frontal cortex, piriform cortex and hippocampus. Second, the AT2 receptors were expressed exclusively in neurons. In our immunofluorescent stainings we were able to prove that the striatal AT2 receptor positive cells had long neurites and co-expressed MAP2 in contrast to other AT2 receptor positive neurons away from the periinfarct area. Third, there was no significant change in the expression of AT1 receptor between stroke and sham animals. Interestingly, many of the AT1 receptors were located in astrocytes and only sparsely in cortical neurons, which coincided with the in vitro results of Sumners et al. Many of the astrocytes in the periinfarct area appeared stouter, had powerful projections and were located around neuron-like cells. These „activated” astrocytes were significantly increased in number in both hemispheres when compared to the sham group (p<0.001), especially in the right hemisphere (p<0.0001). A lot of the activated astrocytes were also positive for the apoptotic marker cCasp-3, which is quite understandable, knowing that astrocytes are highly sensitive to ischemia. The significant reactive astrogliosis is supposed to have both injurious and beneficial effects on neurons. Because of the AT1 receptor localization in astrocytes, we think that the AT1 receptor could be closely related with the processes of apoptosis and inflammation. We were not able to find any co- localisation of AT1 receptor with cCasp-3 but since ischemia and apoptosis are strongly dynamic processes, further detailed studies are needed to exclude or prove such an interaction. Furthermore, we think that the expression of AT2 receptors in neurons is a sign of the previously in vitro suspected neuroprotective effect of the AT2 receptors. We found no co-expression of the AT2 receptor and markers of inflammation (ED1 and CD11b) but we still have to study the co-expression of the AT2- receptor and markers of apoptosis. Bearing in mind the positive results of AT1 antagonists in patients with cerebral ischemia, it appears possible that the surplus of angiotensin during AT1 receptor blockade activates the AT2 receptors, which leads to neuronal regeneration and growth. Of course, because of the AT1 receptor localization in astrocytes, and astrocytes being known for having both harmful and beneficial effects, it is possible that direct inhibition of the AT1 receptor itself induces reduction of apoptosis. Certainly, a combination of both effects is also possible. What will be then the role of the AT2 receptor, if it co-localises with cCasp-3? To conclude, we were able to throw new light on the importance of the AT2 receptor expression in the brain. Our experiments demonstrate a clear upregulation of AT2 receptor expression in neurons of ischemic brain and seemed to promote neuronal survival and neurite outgrowth, and thus support a better neurological outcome, a result, which coincided well with in vitro studies. This finding offers a good explanation for the positive effect of ARBs on reducing ischemic injury and improving neurological deficits. In contrast, the AT1 receptors were not upregulated and were located predominantly in perivascular astrocytes. There was a marked increase of reactive astrocytes in the periinfarct area. In the constellation of obvious reactive astrogliosis and initiated apoptosis, it is possible that these two processes are influenced by AT1 receptor expression. We once again realized that brain damage and brain repair is a complex and dynamic process, where the collaboration between neurons and astrocytes plays an important role, and where the decision to live or die (apoptosis versus regeneration) run on a thin line. Further experiments using a selective AT1 receptor antagonist and/or AT2 receptor antagonist as well as an agonist are needed to further clarify the interactions between neurons, astrocytes, inflammatory cells and the AT1 / AT2 receptor expression. Further new insights in the signaling mechanism that take place in the neuronal and glial cells via the AT1– and AT2 receptors responsible for the neuroprotective effects will grant the medical world to possibility to treat patients effectively and quickly, and even to offer preventive therapy.

Das Renin-Angiotensin-System (RAS) ist mit seinen Wirkungen als Regulator des Blutdruckes oder der Flüssigkeit- und Elektrolytenbalance bekannt und gut erforscht. Die Mehrheit seiner Wirkungen wird über Angiotensin II vermittelt. Zusätzlich zu dem „zirkulierenden“ RAS existiert auch die so genannte „Gewebe RAS“, z.B. im Herzmuskel, in der Lunge und der Leber, in den Gefäßen und im Uterus, jedoch glaubte man zuerst RAS existiere nur in der Peripherie. Später gelang der Nachweis aller Ras-Komponenten auch in der CNS und mit der Entwicklung selektiver Rezeptor-Antagonisten wurden die AT1- und AT2- Rezeptoren weiter charakterisiert. Diese beiden Rezeptorsubtypen scheinen eine wichtige Rolle in ischämischen Prozessen zu spielen. Zahlreiche Studien zeigten, dass der AT1-Rezeptor der “Hauptprotagonist” des RAS ist und dass er stark im adulten Gehirn exprimiert ist, während der AT2-Rezeptor zahlreich während der Ontogenese vorhanden ist jedoch nach der Geburt nur in wenigen Organen exprimiert wird. Deswegen ist der AT1-Rezeptor ausführlich erforscht worden während über den AT2-Rezeptor zum jetzigen Zeitpunkt weniger Daten vorliegen. Größtenteils handelt es sich dabei um in vitro- Modelle. Unser Ziel war also die Expression und das Verteilungsmuster beider Rezeptoren in vivo nachzuweisen und die Zelltypen zu identifizieren, die den AT1-Rezeptor und/oder den AT2-Rezeptor exprimieren. Darüber hinaus wollten wir eine Korrelation zu der Entzündungsreaktion und Apoptose finden, welche die zerebrale Ischämie begleiten. Mittels einer über 90 min. Okklusion der rechten ACM induzierten wir eine transiente fokale zerebrale Ischämie (FCI) in der Schlaganfallgruppe, während die Kontrollgruppe (scheinoperiert) nur eine oberflächliche Haut-OP unterzogen wurde. Nach Durchführung diverser immunohistologischen, molekularen und proteinbiochemischen Methoden, stellten wir signifikante Unterschiede fest. Wir konnten nachweisen, dass der AT2-Rezeptor nach FCI eine deutlich erhöhte Expression zeigte, insbesondere im Striatum, Frontalkortex, Lobus piriformis und Hippocampus. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass der AT2-Rezeptor ausschließlich in Neuronen exprimiert wurde. Zudem zeigten in unseren Immunofluoreszenz-Färbungen einige der striatalen Neurone um die Infarktzone lange Neuriten und waren MAP2-positive, ein Zeichen für Regeneration und Wachstum. Im Unterschied dazu konnten wir keine relevante Differenz in der Expression des AT1-Rezeptors feststellen. Viele der AT2-Rezeptoren befanden sich in Astrozyten und nur gering in Neuronen. Dieser zunächst überraschend erscheinende Befund ist jedoch gut mit den Ergebnissen von Sumners et al vereinbar. Anderseits, waren viele der Astrozyten verplumpt, zeigten prominente Ausläufer (Füße) und umgaben neuronenähnliche Zellen. Diese aktivierten Astrozyten waren deutlich in beiden Hemisphären der Schlaganfallgruppe im Vergleich zu der Schein- operierten Gruppe (p<0,001) vermehrt, insbesondere in der rechten Hemisphäre (p< 0,0001). Viele der aktivierten Astrozyten waren positive für cCasp-3 - kein überraschendes Ergebnis, da Astrozyten gegenüber Ischämie hoch sensibel sind. Es wird vermutet, dass die reaktive Astrogliose sowohl schädliche als auch günstige Auswirkung auf Neuronen hat. Da der AT1-Rezeptor in Astrozyten exprimiert wird, glauben wir, dass er eng mit den Prozessen der Entzündung und Apoptose verbunden ist. Wir konnten keine Kolokalisation des AT1-Rezeptors und der cCasp-3 darstellen, da jedoch Ischämie und Apoptose sehr dynamische Prozesse sind, sind weitere detaillierte Experimente notwendig um eine AT1-Rezeptor Interaktion auszuschließen. Darüber hinaus glauben wir, dass die AT2-Rezeptor Expression in Neuronen ein Zeichen der neuroprotektiven Wirkung dieses Rezeptors ist. Wir konnten keine Koexpression von AT2-Rezeptor und Entzündungs- oder Apoptose-Markern nachweisen. Unter Berücksichtigung der positiven Effekte von AT1-Rezeptor-Blocker im klinischen Alltag (verbesserte neurologische Defizite, schnellere Genesung) erscheint es denkbar, dass der Überschuss an Angiotensin II durch die Blockade der AT1-Rezeptoren eine Aktivierung der AT2-Rezeptoren bewirkt, die ihrerseits verstärkte Neuroregeneration und Wachstum hervorrufen. Anderseits ist auch eine Reduktion der Apoptose durch die Blockade der AT1-Rezeptoren als Ursache der verbesserten Klinik möglich (da die AT1-Rezeptoren großteils auf Astrozyten exprimiert sind und die Astrozyten teils schädliche teils positive Effekte auf Neuronen und Matrix haben). Selbstverständlich ist auch eine Kombination aus beiden Wirkungen möglich. Zusammenfassend belegen die im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation vorgestellten Ergebnisse, dass nach einer zerebralen Ischämie eine deutliche Erhöhung der Expression des AT2-Rezeptors in Neuronen vorliegt, welche das Überleben, Regeneration und Wachstum der Neuronen fördert und somit die Verbesserung der neurologischen Defizite. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den in-vitro Untersuchungen überein. Der AT1-Rezeptor wurde dagegen nicht überexprimiert und befand sich großteils in perivaskulär gelegenen Astrozyten. In der Periinfarktregion befand sich eine deutliche reaktive Astrogliose. Diese und die nachgewiesene initiierte Apoptose werden möglicherweise durch den AT1-Rezeptor beeinflusst. Wir stellten zum wiederholten Mal fest, dass die Schädigungs- und Reparaturmechanismen des Gehirnes eines komplexen und dynamischen Systems unterliegen, in welchem die Zusammenarbeit von Neuronen und Astrozyten eine wichtige Rolle spielt. Weitere Experimente mit selektiven AT1-/ AT2-Rezeptor-Antagonisten oder Agonisten sind notwendig um die Interaktionen zwischen Neuronen, Astrozyten, Entzündungszellen und die Expression von AT1-/ AT2-Rezeptoren besser eruieren zu können und um die Signalmechanismen für die neuroprotektive Wirkung der Angiotensin-Rezeptor-Blocker zu klären. Diese würden einen großen Beitrag für die bessere und schnellere Behandlung der Patienten leisten und möglicherweise sogar eine präventive Therapie ermöglichen.