Structural and functional characterization of A-kinase anchoring protein 18

Abstract

Cyclic 3´, 5´-adenosine monophosphate (cAMP)-dependent kinase, also known as protein kinase A (PKA), is one of the major effectors of the second messenger cAMP in the cell. By binding of cAMP to its regulatory (R) subunits, the associated catalytic (C) subunits are released from inhibition and are activated to phosphorylate target proteins at serine and threonine residues. One way to confer specificity to PKA action is the so-called compartmentalization of PKA signaling. That means that PKA activity is restricted both in space and in time. A-kinase anchoring proteins (AKAPs) serve as molecular scaffolds that both bind PKA regulatory subunits and target the kinase to certain subcellular departments of the cell. They accomplish this by interaction with target proteins, bringing them in close proximity to the kinase, and with other proteins involved in signal transduction. In this way, AKAPs form multi-protein signaling modules that regulate, focus, and integrate different signals inside the cell. To understand AKAP function and the mechanism of their interaction with the PKA R subunit as well as with other interaction partners, the structural determinants of the interaction of AKAP18 with RIIα, the phosphodiesterase PDE4D3, and phospholamban (PLN) were investigated. There are four splice variants of AKAP18 known, called AKAP18α, β, γ, and δ. They share a common PKA-binding site, which is highly conserved. Large-scale purification of the most promising truncated constructs of these isoforms was established and yielded highly pure protein for structural investigation. The constructs containing the PKA binding site were co-purified with the D/D domain, the N-terminal domain of the R subunit that interacts with AKAPs. It was shown that purified proteins and the co-purified complex are correctly folded and functional. AKAP18 binds 5´AMP and the Kd for binding was determined to be in the low micromolar range, independent of the presence of the D/D domain. Crystallization of a complex of AKAP18 γ or δ isoforms in complex with D/D was not successful, but the complex might be amenable to NMR spectroscopy. The interaction of AKAP18δ with PDE4D3 and PLN was investigated by NMR spectroscopy, isothermal titration calorimetry, analytical gel filtration, co-crystallization with synthetic peptides, and by pull-down studies, but a stable complex could not be verified.

Zyklisches 3´,5´-adenosinmonophosphat (cAMP)-abhängige Kinase, auch bekannt als Proteinkinase A (PKA), ist eines der Hauptzielproteine des sekundären Botenstoffs cAMP in der Zelle. Wenn cAMP an die regulatorische (R) Untereinheit der PKA bindet, werden die vorher gebundenen katalytischen (C) Untereinheiten freigesetzt, wodurch diese aktiviert werden. Ein wichtiges Mittel, um der PKA-Aktivität Spezifität zu verleihen, ist die sogenannte Kompartmentalisierung. Darunter versteht man die räumliche und zeitliche Beschränkung der PKA Signaltransduktion in der Zelle. A-kinase Ankerproteine (AKAPs) dienen dabei als molekulare scaffolds („Gerüstproteine“), die einerseits R-Untereinheiten der PKA binden können und diese dann, andererseits, aber auch an bestimmte subzelluläre Kompartimenten verankern können. Zusätzlich interagieren AKAPs mit Substraten der PKA, um diese in die Nähe der Kinase zu bringen, sowie mit anderen Proteinen, die in die Signaltransduktionskette involviert sind. Damit bilden AKAPs die Basis für Signalmodule, die aus unterschiedlichen Proteinen bestehen, und verschiedenste Signale regulieren, bzw. integrieren. Um die Funktion von AKAPs besser zu verstehen und um Interaktionsmechanismen mit der R-Untereinheit der PKA sowie mit anderen Interaktionspartnern zu beleuchten, wurden die Wechselwirkungen von AKAP18 mit RIIα, der Phosphodiesterase PDE4D3 und Phospholamban (PLN) untersucht. Es gibt vier verschiedene Splicevarianten von AKAP18, AKAP18 α, β, γ und δ, die alle eine hochkonservierte PKA-bindestelle besitzen. Für strukturelle Untersuchungen wurde die Aufreinigung trunkierter Konstrukte verschiedener AKAP18 Isoformen etabliert, die hochreines Protein im Milligrammmaßstab ergab. Für die Aufreinigung der AKAP18-konstrukte mit der PKA-bindestelle wurde die D/D-domäne, die N-terminale Domäne der R-Untereinheit, die für die Interaktion mit AKAPs zuständig ist, co- aufgereinigt. Mit Hilfe von nuclear magnetic resonance (NMR) Spektroskopie und anderen biophysikalischen Methoden konnte gezeigt werden, dass die so hergestellten Proteine korrekt gefaltet und funktional sind. Die längeren AKAP18-isoformen binden 5´AMP und der KD für die Bindung wurde ermittelt. Er liegt im unteren, mikromolaren Bereich, unbeeinflusst von der Anwesenheit der D/D-domäne. Die Versuche, AKAP18γ und δ Isoformen im Komplex mit der D/D-domäne zu kristallisieren, blieben erfolglos, aber die Struktur ist eventuell durch NMR-Spektroskopie lösbar. Die Interaktion von AKAP18δ mit PDE4D3 und PLN konnte weder mittels NMR-Spektroskopie, Isothermaler Titrationskalorimetrie, analytischer Gelfiltration, Co-Kristallisation noch in pulldown-Studien verifiziert werden.