Modulation epithelialer Zell-Zellkontakte durch TFF3

Abstract

Das spezielle Interesse dieser Arbeit lag auf der Untersuchung epithelialer Zell-Zellkontakte unter dem Einfluß von hTFF3. Es wurde der E-Cad-herin /Catenin-Adhäsionskomplex sowie der Gehalt von Tight Junctions-Komponenten in FLAG-hTFF3-transfizierten und entsprechenden Leerplasmid-transfizierten Epithelzellen analysiert. Dazu wurden zwei polare, epitheliale Zelllinien (HT29/B6 und MDCK) stabil mit FLAG-getagtem hTFF3 transfiziert. Um zu überprüfen, ob das FLAG-getagte hTFF3 funktionell aktiv ist, wurde zunächst das Migrationsverhalten der stabil transfizierten HT29/B6 Klone analysiert. In Migrationsassays zeigte sich, dass die FLAG-hTFF3-transfizierten HT29/B6 Klone schneller wandern als die entsprechenden Kontroll-zellen. Western Blot Analysen ergaben, dass der zelluläre Gehalt an E-Cadherin sowie an a- und b-Catenin in den FLAG-hTFF3-transfizierten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollzellen vermindert ist. Diese Beobachtung konnte anhand von Immunfluoreszenz-Unter-suchúngen bestätigt werden. Desweitern traten in den FLAG-hTFF3-transfizierten Zellklonen vermehrt Umlagerungen im Aktin- cytoskelett auf. Die Reduktion des E-Cadherin Gehalts beruht teilweise auch auf einer verminderten transkriptionellen Expressionsrate von E-Cadherin. So zeigten sich bei Multiplex RT-PCR- und Real-Time RT-PCR-Analysen, dass der E-Cadherin mRNA-Gehalt in FLAG-hTFF3-transfizierten Zellen deutlich reduziert ist. Methylierungsspezifische PCRs gaben keine Hinweise auf ein verändertes Methylierungsmuster im Bereich des E-Cadherin Promotors. Auch bei der RT-PCR- Analyse von Snail-1, Slug, SIP-1 und E12/E47 konnte nicht festgestellt werden, dass unter dem Einfluß von hTFF3 die Expression dieser als E-Cadherin Repressoren wirkenden Transkriptionsfaktoren verändert ist. Desweiteren wurde eine mögliche posttranskriptionale Ursache des verminderten E-Cadherin-Gehalts untersucht. Aus Pulse-Chase Experimenten ergab sich zudem, dass in den FLAG- hTFF3-transfizierten HT29/B6 Zellen die Halbwertzeit von E-Cadherin von 7,9 h auf 3,7 h verringert wird, als Zeichen einer gesteigerten proteolytischen Degradation. Bei Western Blot und Immunfluoreszenz-Analysen von Tight Junction Proteinen wurde in den FLAG-hTFF3-transfizierten Zellen einen verminderten Gehalt an Claudin-2 nachgewiesen. RT-PCR-Untersuchungen zeigten, dass die Reduktion des zellulären Claudin-2 Gehalts mit einer verminderten Claudin-2 Transkription einhergeht. Somit konnte mit dieser Arbeit gezeigt werde, dass in Epithelzellen die Wirkung von TFF3 auf den E-Cadherin/Catenin-Komplex sowohl über transkriptionelle als auch über posttranskriptionelle Regulationsmechanismen erfolgt. Zudem konnte mit der Herab-regulation von Claudin-2 erstmalig gezeigt werden, dass TFF3 auch einen Einfluß auf die Tight Junctions ausübt. Diese koordinierte Modulation der Adherens Junctions und der Tight Junctions spiegelt die wichtige Bedeutung von TFF3 für die Gewebeprotektion, die Wundheilung und die epithelialen Restitution sowie die Induktion des invasiven Zellwachstums von Tumorzellen wieder.

TFF peptides (TFF1-3) represent a family of small, secreted polypeptides characterized by a trefoil-like three-loop structure. They are constitutively expressed in mucous epithelial tissues where they have a protective function by stabilizing the extracellular mucus layer and act as motogenic factors during epithelial restitution after wounding and during inflammation. In contrast to this beneficial functions, TFF peptides induce cell scattering and invasion in tumor cells. These processes are accompanied by a modulation of cell-cell contacts. Here we analyzed the E-cadherin/catenin adhesion complex in hTFF3 and control transfected epithelial cells as well as the cellular amount of tight junctions components. Consistent with the motogenic function, FLAG-hTFF3 transfected cells revealed enhanced cell migration in gap-filling assays. On Western blots the levels of E-cadherin, a- and b-catenin were reduced. This was confirmed by immunfluorescence microscopy. Moreover, transfected cells showed enhanced stress fiber formation. Posttranslational down-regulation of E-cadherin leads to a reduction of half life from 7.9 h to 3.7 h as shown in pulse-chase experiments. In addition down-regulation of E-cadherin is mediated at the transcriptional level as shown by Multiplex-RT- PCR and quantitative RT-PCR. Methylation-specific PCRs did not reveal changes in promoter methylation. No significant changes in the mRNA levels of the known E-cadherin transcriptional repressors Snail1, Slug, SIP-1, E12/E47 were detectable. In addition reduced protein levels of claudin-2 were detectable in FLAG-hTFF3 transfected cells in Western blot and immunfluorescence analyses. RT-PCR studies show that the transcriptional downregulation of claudin-2 is involved in this reduction. In conclusion TFF3 modultes cell-cell contacts by complex transcriptional and post-translational mechanisms, emphasizing the important role of TFF3 in tissue protection, wound healing and epithelial restitution and also in cell scattering and invasion.