Indian hedgehog signaling during endochondral ossification

Abstract

The majority of skeletal elements in vertebrates is formed by endochondral ossification, a multistep process during which a cartilage template is replaced by bone. Chondrocytes in the cartilage model proliferate and starting from the center they differentiate into hypertrophic chondrocytes, which are subsequently substituted by bone. Two secreted molecules, Indian hedgehog (Ihh) and Parathyroid hormone-like hormone (Pthlh), form a negative feedback loop to regulate hypertrophic differentiation: Ihh, which is expressed in early hypertrophic chondrocytes, activates Pthlh expression in periarticular cells at the distal end of the skeletal elements. Pthlh signals back to the proliferating chondrocytes to prevent the onset of hypertrophic differentiation. In addition, Ihh directly regulates the proliferation of chondrocytes. One of the critical question to understand the role of Ihh is, how the Ihh signal is propagated in the growth plate and how its different functions are mediated. Previous studies in Drosophila have shown that tout- velu (ttv), encoding for a heparan sulfate (HS) polymerase, is required for hedgehog movement. Furthermore, mutations in the human homolog of ttv, EXT1, lead to the �Hereditary Multiple Exostosis� syndrome, a disorder characterized by the formation of benign bone tumors arising from growth plates of long bones. In this study we have analysed, if HS regulates Ihh signaling during endochondral ossification. We investigated a mouse line carrying a hypomorphic allel of Ext1 (Ext1Gt/Gt). These mice produce only 3% of wild-type transcript leading to reduced levels of HS. Characterization of chondrogenesis in Ext1Gt/Gt mice revealed that hypertrophic differentiation is severly delayed mimicking an Ihh overexpression phenotype. In addition, the proliferation rate of periarticular chondrocytes was upregulated. Analysis of Ihh distribution revealed that reduced levels of HS lead to an elevated range of Ihh signaling. In contrast, treatment with ectopic HS resulted in a restricted distribution of the Ihh protein. Together these experiments demonstrate that HS negatively regulates the range of Ihh signaling in a concentration dependent manner in cartilage. Additionally, our data strongly indicate that Ihh acts as a long range morphogen directly activating Pthlh expression. As binding of Fibroblast growth factors (Fgf) to their receptors has been shown to depend on HS, we analysed Fgf signaling in Ext1Gt/Gt mice. Ectopic activation of Fgf signaling did not rescue the delayed onset of hypertrophic differentiation in Ext1Gt/Gt mice. In addition, Ext1Gt/Gt limbs respond to treatment with Fgf protein. Therefore low levels of HS seem to be sufficient for Fgf signaling in this mouse model. To understand how the Ihh signal is translated, we started to analyse downstream transcription factors of the Gli gene family. Several lines of evidence have shown, that Gli3 acts mainly as a repressor, wheras Gli1 and Gli2 function as activators downstream of Shh during neural tube development. To elucidate the role of Gli3 downstream of Ihh during endochondral ossification we analysed Ihh-/-;Gli3-/- double mutant mice. Ihh deficient mice are characterized by severly reduced chondrocyte proliferation and an accelerated onset of hypertrophic differentiation. Remarkably, loss of Gli3 rescues both aspects of chondrocyte differentiation in Ihh deficient mice. On molecular level the expression of Patched (Ptch) and Pthlh, which are lost in Ihh deficient mice, is restored in the double mutants. Therefore, Ptch and Pthlh seem to be transcriptional targets of the Gli3-repressor form. Surprisingly, Gli3 mutant mice only display a weak phenotype. Detailed analysis revealed, however, that the zone of periarticular chondrocytes is reduced in Gli3 mutant limbs. Furthermore, the expression domain of Pthlh is shifted to the most distal cells of the skeletal elements. Together these results revealed a new function of the Ihh-Gli3 signaling system in regulating the differentiation of periarticular into columnar chondrocytes.

Die Mehrzahl der Skelettelemente der Vertebraten entsteht durch die endochondrale Ossifikation, ein mehrstufiger Prozess, bei dem eine Knorpelanlage durch Knochen ersetzt wird. Chondrozyten in der Knorpelanlage proliferieren und differenzieren ausgehend von der Mitte in hypertrophe Chondrozyten, welche anschließend durch Knochen ersetzt werden. Zwei sezernierte Signalfaktoren, Indian Hedghehog (Ihh) und "Parathyroid hormone like hormone" (Pthlh) bilden einen negativen Rückkopplungskreis, der die hypertrophe Differenzierung reguliert: Ihh, welches von frühen hypertrophen Chondrozyten exprimiert wird, aktiviert die Expression von Pthlh in den periartikulären Zellen am distalen Ende der Skelettelemente. Pthlh signalisiert zurück zu den proliferierenden Chondrozyten, um das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung zu inhibieren. Zusätzlich reguliert Ihh direkt die Proliferation der Chondrozyten. Eine wichtige Frage, um die Rolle von Ihh zu verstehen, ist, wie das Ihh Signal in der Wachstumsfuge weitergeleitet wird und wie es die verschiedenen Funktionen auf transkriptioneller Ebene umsetzt. Studien in Drosophila haben gezeigt, dass Tout-velu (ttv), welches für eine Heparan Sulfat Polymerase kodiert, für den Hedgehog-Transport notwendig ist. Darüber hinaus führen Mutationen in dem humanen ttv Homolog EXT1 zum "Hereditary Multiple Exostosis" Syndrom, einer Erkrankung, die durch die Bildung von gutartigen Knochentumoren gekennzeichnet ist, welche aus der Wachstumsfuge der Röhrenknochen heraus entstehen. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir untersucht, ob HS den Ihh Signalweg während der endochondralen Ossifikation reguliert. Wir analysierten eine Mauslinie, die ein hypomorphes Allel von Ext1 trägt (Ext1Gt/Gt). Diese Mäuse produzieren nur 3% des Wildtyp Transkriptes, so dass reduzierte Mengen an HS gebildet werden. Die Charakterisierung der Chondrogenese dieser Ext1Gt/Gt Mäuse ergab, dass das Einsetzen der hypertrophen Differenzierung stark verzögert ist und dem Phänotyp Ihh überexprimierender Mäuse ähnelt. Zusätzlich ist die Proliferationsrate der periartikulären Chondrozyten hochreguliert. Die Analyse der Verteilung des Ihh Proteins zeigte, dass reduzierte Mengen an HS eine erhöhte Reichweite des Ihh Signals ermöglichen. Im Gegensatz dazu führt die Behandlung mit ektopischem HS zu einer Einschränkung der Reichweite des Ihh Proteins. Folglich begrenzt HS konzentrationsabhängig die Reichweite des Ihh Signals im Knorpel. Zusätzlich weisen unsere Daten darauf hin, dass Ihh als Morphogen über große Distanzen agiert und dabei direkt die Expression von Pthlh induziert. Da HS ebenfalls für die Bindung der "Fibroblast growth factors" (Fgfs) an ihren Rezeptors essentiel ist, haben wir den Fgf-Signalweg in Ext1Gt/Gt Mäusen analysiert. Die ektopische Aktivierung des Fgf-Signalweges konnte der verzögerten hypertrophen Differenzierung der Ext1Gt/Gt Mäuse nicht entgegenwirken. Zudem reagieren Gliedmaßen von Ext1Gt/Gt Mäusen auf eine Behandlung mit Fgf-Protein. Folglich scheinen die geringen Mengen an HS der Ext1Gt/Gt Mäuse ausreichend für die Aktivierung des Fgf-Signalweg zu sein. Um zu verstehen, wie das Ihh Signal umgesetzt wird, haben wir begonnen, die Rolle der nachgeschalteten Transkriptionsfaktoren der Gli Genfamilie zu untersuchen. Verschiedene Untersuchungen der Entwicklung des Neuralrohrs haben gezeigt, dass Gli3 hauptsächlich als Repressor wirkt, während Gli1 und Gli2 als Aktivatoren fungieren. Um die Rolle von Gli3 downstream von Ihh während der endochondralen Ossifikation aufzuklären, haben wir Ihh-/-;Gli3-/- Doppelmutanten untersucht. Ihh defiziente Mäuse sind durch eine stark verminderte Proliferationsrate ihrer Chondrozyten und durch ein beschleunigtes Einsetzen der hypertrophen Differenzierung charakterisiert. Bemerkenswerterweise, wirkt der Verlust von Gli3 beiden Aspekten der Chondrozytendifferenzierung in Ihh defizienten Mäusen entgegen. Auf molekularer Ebene ist die Expression von Patched (Ptch) und Pthlh, die in Ihh defizienten Mäusen nicht detektierbar ist, in den Doppelmutanten wieder hergestellt. Daher scheinen Ptch und Pthlh transkriptionelle Zielgene des Gli3 Repressors zu sein. Überraschenderweise zeigen Gli3 Mutanten nur einen schwachen Phänotyp. Allerdings hat die detailierte Analyse von Gliedmaßen mutanter Gli3 Mäuse ergeben, dass sie eine reduzierte Zone von periartikulären Chondrozyten besitzen. Zusätzlich ist die Expressionsdomäne von Pthlh an den distalen Randbereich der Skelettelemente verschoben. Diese Ergebnisse zeigen eine neue Funktion des Ihh-Gli3 Systems in der Regulierung der Differenzierung von periartikulären zu säulenartigen Chondrozyten auf.