Die Rolle von TRAF6 und seines Effektors NF-kappaB bei der Myoblastendifferenzierung

Abstract

Die Regulation der Proliferation und Differenzierung von Muskelzellen ist ein komplexer und hoch organisierter Prozess, durch den während der Embryonalentwicklung die Entwicklung des Muskelgewebes kontrolliert wird. Wachstumsfaktoren, myogene Regulationsfaktoren und andere Faktoren wie Signaltransduktionsproteine nehmen direkt oder indirekt Einfluss auf diese Prozesse und steuern somit die Entwicklung und Regeneration von Muskelzellen. Über eine mögliche Rolle des Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Adaptorproteins TRAF6 bei Proliferations- und Differenzierungsprozessen der Skelettmuskulatur war vor Beginn dieser Arbeit nichts bekannt gewesen. Die TRAFs gehören zu einer Familie von Adaptorproteinen, die ursprünglich aufgrund ihrer Beteiligung an der Signaltransduktion durch TNF-Rezeptor identifiziert wurden. Heute weiß man, dass sie auch an weiteren Rezeptoren der TNFR-Familie bei der Signalweiterleitung eine Rolle spielen und sie an vielen physiologischen Prozessen beteiligt sind. So zeigen TRAF6-defiziente Mäuse nicht nur Defekte bei der ektodermalen Differenzierung sondern auch eine stark ausgeprägte Osteoporose durch fehlerhafte Osteoklastendifferenzierung. Desweiteren zeigten diese knockout Studien, dass TRAF6 bei Entzündungs- und Immunreaktionen und bei der Ausbildung des Immunsystems essentiell ist. In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster des traf6-Gens in verschiedenen Muskeltypen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen in vivo und in vitro untersucht. Dabei lassen die in vivo-Daten einen Zusammenhang zwischen Repression der traf6-Expression und der Regeneration der Skelett- und Herzmuskulatur vermuten: Für diese Untersuchungen wurde die mdx-Maus als Tiermodell für die x-chromosomal rezessiv vererbte Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) gewählt. Der entsprechende genetische Defekt bewirkt einen Mangel an Dystrophin, woraus eine chronische Degeneration von Muskelgewebe resultiert. Aufgrund der effizienten Regenerationsfähigkeit von Muskelgewebe und der Tatsache, dass die Regeneration der Skelettmuskulatur durch de novo- Differenzierung von Satellitenzellen (Myoblasten) bewirkt wird, stellt die mdx-Maus ein in vivo-Modell der Skelettmuskeldifferenzierung dar. Vor diesem Hintergrund scheint die beobachtete Repression des traf6-Gens in der Muskulatur der mdx-Maus mit dem Regenerationsprozess assoziiert zu sein. Außerdem konnte bei Mäusen, die eine Prädisposition für eine Kardiomyopathie aufweisen, eine deutlich erhöhte traf6-Expression im Herzmuskel gemessen werden. Weiterhin konnte an normalen Myoblasten gezeigt werden, dass während der Myoblastendifferenzierung eine Repression der traf6-Genexpression erfolgt. Durch verschiedene in vitro-Untersuchungen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass das Differenzierungspotential von Myoblasten mit dem Grad der Repression der traf6-Expression nach Induktion der Differenzierung assoziiert ist. In darauf aufbauenden funktionellen Experimenten, in denen durch siRNA- Technik die Expression des traf6-Gens reduziert wurde, konnten die zuvor generierten Ergebnisse untermauert werden. So war nach Repression des traf6-Gens insbesondere die Proliferationsfähigkeit der untersuchten Myoblasten reduziert. Die Analyse verschiedener Differenzierungsmarker nach traf6 siRNA-Behandlung ergab demgegenüber teilweise divergierende Effekte. Daher muss die Rolle von TRAF6 bei der Myoblastendifferenzierung in weiterführenden Studien noch genauer analysiert werden. Abschließend konnte nachgewiesen werden, dass auch die Hemmung der Aktivität des TRAF6-Effektors NF-B durch verschiedene Wirkstoffe, das Proliferations- und Differenzierungsverhalten der untersuchten Myoblasten-Zelllinien beeinflusst. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass TRAF6 eine fördernde Funktion bei der Regulation der Proliferation von Skelettmuskelzellen ausübt. Weitere Untersuchungen zur Rolle von TRAF6 bei Differenzierungsprozessen sollten die Vermutung untermauern, dass eine Repression des traf6-Gens für die Muskeldifferenzierung unerlässlich ist. Desweiteren konnten Hinweise erhalten werden, dass TRAF6 mit den komplexen Vorgängen der Skelettmuskelregeneration assoziiert ist.

The regulation of the proliferation and differentiation of myoblasts is a complex and highly organized process which controls the development of muscle tissue during embryonic development. Growth factors, myogenic regulation factors and further factors such as signal transduction proteins have a direct or indirect influence on these processes and, as a consequence, are controlling the development and regeneration of muscle cells. The potential effects of tumor necrosis factor receptor-associated protein-6, TRAF6, on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells were unknown prior to the start of the present research work. The TRAFs belong to a family of adaptor proteins which initially have been identified due to their support of signal transduction through TNF receptors-1 and -2. Today, it is well known that they also play a role in signaling processes initiated by further receptors of the TNFR family and that they participate in many physiological processes. TRAF6-deficient mice, for instance, do not only show defects with respect to ectodermal differentiation but also feature osteoporosis due to aberrant osteoclast differentiation. Furthermore, these knockout studies proved that TRAF6 is essential for inflammation and various immune reactions as well as for the build-up of a functional immune system. This thesis analyzes the expression pattern of the traf6 gene in different muscle types under physiological and pathological conditions in vivo and in vitro. Specifically, the in vivo data demonstrate that differential traf6 expression is associated with degeneration and regeneration of striated muscle tissue. This study was carried out with the mdx mouse, an animal model for the x-chromosomally recessively inherited human disease Duchenne Muscle Dystrophy (DMD). The corresponding genetic defect causes a lack of dystrophin, which, in turn, results in a degeneration of muscle tissue. Because of the efficient regeneration of mdx muscle tissue, primarily via satellite cells (myoblasts), which undergo degeneration-induced proliferation and differentiation processes, this mouse is a model for de novo myoblast differentiation. Thus, our data suggest that the observed repression of the traf6 gene in mdx muscle tissue might associated with myoblast differentiation. Moreover, increased traf6 expression could be demonstrated in heart muscle tissue of mice with CVB3-induced inflammatory cardiomyopathy, demonstrating that differential traf6 expression also occurs during degenerative-regenerative processes in the heart. Moreover, in an in vitro model system of myoblast differentiation, we could demonstrate repression of traf6 expression after the induction of differentiation. Furthermore, studies with different cell lines could show that the myogenic differentiation potential of a given cell line is related to the degree of traf6 gene repression during differentiation. Functional studies using traf6-specific siRNAs partially supported this hypothesis. In particular, myoblast proliferation rate was reduced after traf6 gene repression. The analysis of various differentiation markers after traf6 siRNA treatment, however, was inconsistent. Consequently, the role that TRAF6 is playing in myoblast differentiation needs to be analyzed in more detail in further studies. Finally, we could show that inhibition of the TRAF6 effector NF-B via different drugs inhibited proliferation and enhanced differentiation of different myoblast cell lines. We conclude that TRAF6 has a stimulating effect on skeletal muscle cell proliferation. Further research should unravel a potential association of traf6 gene repression and myogenic differentiation. Furthermore, our data suggest that TRAF6 might be a regulator of striated muscle regeneration.