Untersuchung der bioaktiven Eigenschaften von plättchenreichem Plasma für die Anwendung in der in situ Knorpelregeneration

Abstract

Heutzutage wird plättchenreiches Plasma (PRP) in der regenerativen Medizin immer häufiger zur Unterstützung der körpereigenen Heilungsprozesse angewandt. So konnte anhand einer gut dokumentierten Fallserie belegt werden, dass PRP in Kombination mit Polyglykolsäure-Hyaluronsäure (PGA-HA)-Implantaten und der Mikrofrakturierung bei Patienten mit einem fokalen chondralen Defekt zu einer signifikanten Verbesserung der Konstitution und zu einer Bildung von hyalinem Ersatzgewebe im Defekt führte. Jedoch ist der biologische Effekt von PRP auf die Migration und Knorpelregenration von mesenchymal Stamm- und Vorläuferzellen, wie sie bei der Mikrofrakturierung stimuliert werden, unklar. Daher sollte geklärt werden, welchen Einfluss humanes PRP sowohl auf die Migration als auch auf die Chondrogenese von humanen mesenchymalen Vorläuferzellen (CSP, cortico-spongious progenitor cells) in Hochdichte- Pelletkulturen hat. Um näher an der klinischen Anwendung zu sein, wird zusätzlich die Wirkungsweise von PRP auf CSP-Zellen in PGA-HA-Implantaten untersucht. Außerdem wurden zur Bestimmung der Zusammensetzung möglicher enthaltender chondrogener Wachstumsfaktoren im PRP membranbasierte Antikörpertests durchgeführt und ausgewählte Wachstumsfaktoren mittels enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) quantifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass ein Gehalt an 0,1 % bis 100 % PRP die Zahl an migrierten Zellen gegenüber der Negativkontrolle signifikant (p ≤ 0,05) erhöht. Dabei zeigte sich die höchste Anzahl an migrierten Zellen bei einem PRP Gehalt von 5 %. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass PRP die chondrogene Differenzierung von CSP-Zellen in Hochdichte-Pelletkulturen und CSP-Zellen in PGA-HA-Implantaten sowohl auf Genexpressions- als auch auf Proteinebene stimuliert. In den Pellet- und Implantatenkulturen induzierte 5 % PRP signifikant (p ≤ 0,05) die Expression der typischen chondrogenen Markergene Kollagen Typ II, COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein) und Aggrekan. Auch die Bildung von Proteoglykan- und Kollagen Typ II-reicher Matrix war in Pelletkulturen und PGA-HA-Implantaten zu beobachten. Die Quantifizierung der ausgewählten Wachstumsfaktoren mittels ELISA in PRP ergab eine durchschnittliche Konzentration von 0,31 ng/ml für BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein 2), 0,50 ng/ml für CTGF (Connective Tissue Growth Factor), 0,76 ng/ml für FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2) und 0,59 ng/ml TGF β3 (Transforming Growth Factor-β3). Zusammenfassend ist zu sagen, dass PRP sowohl die Migration von CSP-Zellen als auch die Chondrogenese von CSP-Zellen sowohl in Hochdichte- Pelletkulturen als auch in PGA-HA-Implantaten stimuliert. Somit könnte PRP ein wirkungsvolles Mittel für die lokale Applikation von chondrogenen Wachstumsfaktoren sein, welche dann im Defekt die Knorpelheilung durch Stimulation der Zellmigration und -differenzierung unterstützt.

Today, platelet-rich plasma (PRP) is more and more common in regenerative medicine to support the natural healing process. In a recent case series, 52 patients with focal chondral defects received polyglycolic acid-hyaluronan (PGA-HA) scaffolds augmented with PRP after microfracture. This procedure resulted in a significant improvement of the patients' situation and in the formation of hyaline-like cartilage. However, information about the underlining biological mechanism and about cell migration and cartilage regeneration of mesenchymal stem and progenitor cells are unclear. Therefore, the influence of human PRP on cell migration and chondrogenic differentiation of human subchondral progenitors (CSP, cortico-spongious progenitor cells) in high-density pellet cultures has to be evaluated. In order to be closer to the clinical application the influence of PRP on CSP-cells seeded in PGA-HA scaffolds was determined. For identification of possible chondrogenic growth factor composition Protein Antibody Membrane Arrays were performed. Selected growth factors involved in chondrogenic differentiation were quantified by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). It was shown that a PRP content about 0.1 % up to 100 % increased the number of migrated cells significantly (p ≤ 0.05) compared to the negative control. The highest number of migrated cells was observed at 5 % PRP. Human subchondral progenitors cultivated in high-density pellet cultures or in PGA-HA scaffolds in presence of 5 % PRP showed chondrogenic induction on gene expression and protein level. Gene expression analysis of typical chondrocyte marker genes collagen type II, cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and aggrecan demonstrated that these genes were significantly (p ≤ 0.05) increased in high density pellet cultures and CSP-cell seeded PGA-HA implants. Also the formation of proteoglycan and collagen type II rich matrix was observed in high-density pellet cultures as well as CSP-cell seeded PGA-HA scaffolds. Quantification of selected chondrogenic growth factors in PRP by ELISA showed an average concentration of 0.31 ng/ml bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), 0.50 ng/ml connective tissue growth factor (CTGF), 0.76 ng/ml fibroblast growth factor-2 (FGF 2), and 0.59 ng/ml transforming growth factor-β3 (TGF β3). In conclusion, PRP stimulating the migration and chondrogenic differentiation of CSP-cells in high-density pellet cultures as well as in PGA-HA scaffolds. Therefore, it seemed that PRP is a powerful tool for the local application of chondrogenic growth factors to the site of injury and may support cartilage repair by stimulating cell migration and differentiation.