Studies on pathogen-host interaction: Impact of the emerging zoonotic pathogen Arcobacter butzleri on human macrophages

Abstract

Cases of severe gastroenteritis caused by the new emerging pathogen A. butzleri have been recently reported but data to evaluate the pathogenic potential is sparse. Expanding the knowledge of the interplay between A. butzleri and its host is indispensable to evaluate the pathogenicity and to develop strategies to combat A. butzleri induced diseases. Macrophages have a fundamental role in the first line of host defense and were therefore matter of investigation. The first part of this work focused on the inflammatory response of macrophages as well as intracellular survival and modulation of host cell apoptosis as potential virulence mechanisms employed by A. butzleri. THP-1 cell derived macrophages were used as an in vitro infection model. Induction of IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12β and TNFα demonstrated a proinflammatory response of infected macrophages towards A. butzleri. Gentamycin protection assays revealed the ability of the pathogen to survive and resist the hostile environment of phagocytic immune cells for up to 22 h and apoptosis assays proved the initial induction of adapter- as well as effector caspases which was not followed by DNA damage, suggesting a possible counter regulation. A potential role of miR-106a in this context could not be demonstrated. The considered investigations demonstrate that A. butzleri employs virulence mechanisms to attenuate host defense similar to those used by other severe intestinal pathogens such as Campylobacter jejuni. Additionally, distinct isolate-dependent differences were observed among the strains suggesting the existence of strain-specific phenotype variations possibly exhibiting different virulent potential. The second part of this work concentrated on the role of miRNAs upon Arcobacter infection. The infection of primary human macrophages of three different donors with A. butzleri and subsequent miRNAseq contributed new data to understand the regulatory network of miRNAs expressed during bacterial infection. Analysis of the data revealed the expression of miR-125a, miR-146a, miR-155, miR-212, miR-181b/c/d, miR-21, miR-99b, miR-27a, let-7a, miR-26b and miR-148a. These miRNAs have been reported to be mainly involved in the autoregulative control of a balanced immune response during infectious diseases. Additionally, miRNAs which have not yet been reported to be involved in infectious diseases were expressed in A. butzleri infected macrophages (miR-3613, miR-590, miR-941, miR-2116, miR-671, miR-30d, miR-339, miR-629 and miR-193a). Taken together, the data generated in this study contributes new findings to the existing knowledge about the interplay of the new emerging pathogen A. butzleri with human host cells which is necessary to evaluate the severeness of the disease and develop appropriate therapeutics.

Der bakterielle Zoonose-Erreger A. butzleri, Mitglied der Familie Campylobacteraceae, wurde in jüngeren Veröffentlichungen mit schweren Durchfallerkrankungen in Zusammenhang gebracht. Doch ob und inwiefern A. butzleri tatsächlich krankmachendes Potential besitzt ist unklar. Die vorliegende Studie hatte zum Ziel das bestehende Wissen über den Einfluss von A. butzleri auf Wirtszellen zu erweitern um somit das pathogene Potenzial von A. butzleri besser einschätzen zu können und die Grundlage für die Entwicklung alternativer Therapiemöglichkeiten zu schaffen. Da phagozytierende Zellen des angeborenen Immunsystems eine elementare Rolle in der ersten Immunantwort des Wirtes auf bakterielle Pathogene inne haben, lag der Fokus der Untersuchung auf der Interaktion von A. butzleri und humanen Makrophagen. Der erste Teil der Arbeit untersuchte die Entzündungsantwort der Makrophagen sowie intrazelluläres Überleben und Beeinflussung des programmierten Zelltodes der Wirtszellen (Apoptose) als potentielle Virulenzmechanismen von A. butzleri. Die monozytische Zelllinie THP-1 diente hierfür als Infektionsmodell. Die Induktion der Interleukine IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12β und TNFα demonstrierten eine pro-inflammatorische Wirtsantwort der Makrophagen auf die Infektion. Gentamycin protection assays zeigten, dass A. butzleri die Fähigkeit besitzt für mindestens 22 h in Makrophagen zu überleben. Des Weiteren ergaben Untersuchungen der Caspaseaktivitäten (Caspase 8, 3 und 7), dass eine Infektion mit A. butzleri eine erhöhte Aktivität von sowohl Adapter- als auch Effektorcaspasen initial induziert, diese im Verlauf der Infektion aber wieder abnimmt und letztendlich nicht zum programmierten Zelltod führt. Eine vermutete Rolle von miR-106a in diesem Zusammenhang konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden. Die Untersuchungen zeigten, dass die von A. butzleri genutzten Virulenzmechanismen denen von etablierten Darmpathogenen wie z.B. Campylobacter jejuni ähnlich sind. Zusätzlich zu den Einflüssen von A. butzleri auf Makrophagen konnten teils starke isolatabhängige Unterschiede in den Untersuchungen festgestellt werden, so dass eine stammspezifische Variation des Virulenzpotentials naheliegt. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte die miRNA Antwort primärer humaner Makrophagen auf die Infektion mit A. butzleri. Dafür wurden Makrophagen von 3 verschiedenen Donoren isoliert und infiziert. Die anschließende Sequenzierung der exprimierten miRNAs diente der Erweiterung derzeit bestehender Kenntnisse über die Expression von miRNAs in Wirtszellen während bakterieller Infektionen. Eine Analyse der Daten ergab, dass eine erhöhte Expression besonders diejenigen miRNAs betraf, die für autoregulative Feedbackmechanismen verantwortlich sind, um überschießende Immunreaktionen zu vermeiden. Eine veränderte Expression im Vergleich zur Negativkontrolle zeigten in diesem Zusammenhang miR-125a, miR-146a, miR-155, miR-212, miR-181b/c/d, miR-21, miR-99b, miR-27a, let-7a, miR-26b und miR-148a. Zusätzlich reagierten die Makrophagen mit erhöhter Expression einiger miRNAs, die bis jetzt noch nicht mit bakteriellen Infektionen in Zusammenhang gebracht wurden (miR-3613, miR- 590, miR-941, miR-2116, miR-671, miR-30d, miR-339, miR-629 und miR-193a). Zusammengefasst, tragen die in dieser Studie generierten Daten zum besseren Verständnis der molekularen Interaktion von A. butzleri und humanen Makrophagen bei, einerseits unerlässliche Informationen zur Evaluierung der Pathogenität, andererseits die Basis für die Entwicklung angemessener Therapiemöglichkeiten.