Intratumorale Verteilung, systemische Biodistribution und Clearance eines TNFα exprimierenden MIDGE Vektors nach nicht-viraler in vivo Jet-Injektion

Abstract

Krebs gilt in Deutschland als zweithäufigste krankheitsbedingte Todesursache. Die Etablierung neuer Therapiestrategien steht im Fokus aktueller Forschung. Bereits klinisch angewandt wird die Tumorgentherapie. In der Tumorgentherapie haben sich als Transfersysteme virale Vektoren etabliert, werden wegen ihres Nebenwirkungsspektrums jedoch noch immer hinterfragt. Nicht-virale Vektoren gewinnen deshalb an Interesse und gelten als besonders sicher. Sie erreichen mittels optimierter kleiner Vektorsysteme immer höhere Transfereffizienzen und verbesserte Transgenexpression. Für den Transfer nicht-viraler Vektoren hat sich die Kombination mit physikalischen Transfertechnologien wie zum Beispiel der in vivo Jet-Injektion etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurde im Tiermodell ein neuartiger TNFα exprimierender minimalistischer immunologisch definierter Genexpressionsvektor (MIDGE) mittels Jet-Injektion in xenotransplantierte humane Melanome in vivo intratumoral appliziert. Der Fokus der molekularbiologischen Untersuchungen lag auf der Analyse der Effizienz des MIDGE Vektor Gentransfers, der Vektorverteilung und Clearance in Tumor, Blut und Organen (Leber, Herz, Niere, Lunge, Milz, Ovarien, Hirn). Indikatoren für die Effektivität eines Gentransfers sind der Nachweis des Transgen-tragenden Vektors im Zielgewebe und die Transkription und Translation des Transgens. Die Untersuchungen des Tumorgewebes zeigten neben einer erfolgreichen in vivo Jet- Injektion mit Vektornachweis in der real-time qPCR auch eine effiziente intratumorale Expression des Transgens auf mRNA- und Proteinebene mittels real-time qRT-PCR, ELISA und Immunhistochemie. Diese Ergebnisse sprechen für eine herausragende Effizienz des intratumoralen in vivo MIDGE Vektor Gentransfers. Als Parameter der Sicherheit des Gentransfers muss bestimmt werden, inwieweit die systemische Verteilung des Vektors im Organismus eine rasche Clearance zeigt. Es konnte gezeigt werden, dass es zwar nach intratumoraler Jet-Injektion zur Ausschwemmung von MIDGE Vektor-DNA in den Blutkreislauf und in distante Organe kommt. Jedoch konnte zu keiner Zeit eine mRNA-Transgenexpression beobachtet werden. Darüber hinaus wurde 24 Stunden nach Jet-Injektion in keinem der Organe Transgen nachgewiesen – es war zu einer vollständigen Clearance gekommen. Diese Ergebnisse belegen die hohe Biosicherheit des MIDGE Vektors nach in vivo Jet-Injektion Gentransfer. Als Transgen wurde humanes TNFα verwendet, da es bereits in Kombinationstherapien des malignen Melanoms als potentes Therapeutikum eingesetzt wird. Die lokale Applikation des TNFα tragenden MIDGE Vektors in Verbindung mit geringer Bioverteilung im Organismus ist aufgrund der somit stark minimierten systemischen Nebenwirkungen von besonderem Vorteil. In Kombination mit in vivo Jet-Injektion kann der TNFα exprimierende MIDGE Vektor also in Zukunft zur effektiven, lokal wirksamen Therapie maligner Melanome eingesetzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass MIDGE Vektor und in vivo Jet- Injektion eine vielversprechende Methode in der Tumorgentherapie darstellen, die Voraussetzungen für eine sichere Tumorgentherapie erfüllen und in Zukunft als effektive Therapie eingesetzt werden können.

For nonviral applications of therapeutic DNA, highly efficient and safe vector systems are of crucial importance. In the majority of nonviral approaches plasmid vectors are in use. A novel minimalistic gene expression vector ( MIDGE) has been developed to overcome the limitations of plasmid vectors. This small-size double-stranded linear DNA vector has shown improved transgene expression. However, only limited knowledge on uptake, biodistribution, and clearance of this vector exists. In this study we investigated the intratumoral and systemic biodistribution, clearance, and expression kinetics of the tumor necrosis factor (TNF)-α-carrying MIDGE-CMVhTNF vector in NMRI- nu/nu mice with subcutaneously xenotransplanted human A375 melanoma. Biodistribution was analyzed by quantitative real-time PCR in tumors, blood, and organs 0 to 60 min and 3 to 48 hr after intratumoral jet-injection of 50 µg of MIDGE-CMVhTNF. We examined TNF mRNA expression in tumor tissue and organs, using real-time RT-PCR and TNF-specific ELISA. High levels of MIDGE DNA in the tumor tissue demonstrated efficient gene transfer of the small-size vector, resulting in inhomogeneous DNA dispersion and efficient transgene expression. Intratumoral jet-injection of the vector DNA was accompanied by leakage into the blood circuit and appearance in peripheral organs within 5 min to 6 hr. However, this did not lead to TNF-α expression and was followed by rapid vector clearance resulting in the disappearance of MIDGE DNA 24 hr after gene transfer. These data provide important new information for the kinetics of intratumoral and systemic biodistribution and rapid clearance of the jet-injected small-size MIDGE vector.